Dans le contexte du 7ième amendement de la directive cosmétique européenne, le développement de tests alternatifs à l’expérimentation animale pour prédire le potentiel sensibilisant des molécules chimiques est devenu un enjeu majeur pour les industriels. Un certain nombre de tests in silico / in vitro modélisant les événements précoces de l’allergie retardée de contact ont été développés. Ces tests présentent de bonnes performances pour la détection du danger (sensibilisant versus non sensibilisant), mais la quantification du potentiel reste toutefois limitée. Il est accepté de tous que la combinaison de plusieurs de ces tests in vitro et méthodes in silico dans une batterie prédictive devrait permettre de prédire de manière quantitative le potentiel sensibilisant. Au-delà de la construction de cette batterie, avec les tests déjà disponibles, certains paramètres manquants dans le panorama actuel des tests (pénétration, métabolisme, inflammation) permettraient de moduler les réponses apportées par les tests in vitro utilisés jusqu’ici. Dans cette perspective, nous nous sommes intéressés à caractériser les médiateurs inflammatoires produits par les cellules en réponse à des sensibilisants pour identifier dans quelle mesure cette réponse peut adresser la question du potentiel sensibilisant des molécules.
Comme nous venons de le voir tout au long de la revue bibliographique, les sensibilisants de contact, en tant que molécules réactives, ont la capacité d’induire un « signal de danger » déclenchant au sein de la peau une cascade d’événements conduisant à la maturation des DC, à savoir un changement de phénotype ainsi que la production d’un certain nombre de cytokines/chimokines. Les médiateurs inflammatoires produits par la peau en réponse à des sensibilisants (IL-8, IL-1, TNF-α, IL-6) sont bien décrits dans des modèles in vivo (Enk and Katz, 1992; Grabbe and Schwarz, 1998) mais restent souvent limités à des études transcriptomiques sur des modèles in vitro (Pichowski et al., 2001; Python et al., 2007). Au- delà de ces médiateurs protéiques, les eicosanoïdes et en particulier les prostaglandines sont bien connues pour jouer un rôle majeur dans la maturation des DC (Harizi et al., 2001) mais très peu d’éléments sont décrits sur leur modulation par les sensibilisants de contact. Afin d’étudier la réponse inflammatoire, les modèles cellulaires in vitro de type DC disponibles sont d’une part les cellules dendritiques différenciées à partir de monocytes (moDC) ou de précurseurs CD34+ (CD34-DC) et d’autre part les lignées cellulaires myéloïdes telles qu’U937, THP-1, MUTZ-3 et KG-1. Dans la perspective de développer un test, les moDC et CD34-DC, bien que plus physiologiques sont des modèles qui restent limitants en raison de la complexité de leur préparation, des nombreuses variantes de protocole, de l’importante variabilité qu’il existe entre les donneurs ainsi que pour des raisons
début des années 1997, nous nous sommes focalisés sur la lignée humaine pro-monocytaire U937 pour ses capacités à répondre aux sensibilisants et c’est notamment sur cette lignée que le test MUSST actuellement en pré-validation à l’ECVAM a été développé (Rousset et
al., 2002). Toutefois, contrairement aux moDC et CD34-DC pour lesquelles un certain
nombre de médiateurs solubles a pu être mis en évidence en réponse aux sensibilisants (Aiba et al., 1997; Coutant et al., 1999; Aiba et al., 2000; Pichowski et al., 2000; Tuschl et al., 2000; Pichowski et al., 2001; De Smedt et al., 2002; Aiba et al., 2003; Aeby et al., 2004; Toebak et al., 2006; Szameit et al., 2008; Toebak et al., 2008), les lignées myéloïdes et en particulier la lignée U937 ne produisent pas de médiateurs solubles suite à un traitement avec un sensibilisant (données internes). Les cellules U937 possèdent par ailleurs la capacité à être différenciées principalement en macrophages (Rasaiyaah et al., 2007). Parmi les différentes conditions testées, l’association phorbol myristate acetate (PMA) et le lipopolysaccharide bactérien (LPS) induit la production par les U937 d’IL-1β, TNF-α, IL-6, IL- 8 ainsi que de nombreux prostanoïdes. De façon surprenante, en présence de sensibilisants, on observe une diminution significative de la production de prostaglandines induite par l’association PMA/LPS.
Ainsi, au cours de la thèse, notre objectif a été de mieux caractériser cette signature in vitro des sensibilisants et d’évaluer dans quelle mesure cette réponse corrèle avec le potentiel sensibilisant des molécules. Notre étude s’articule autour de trois grandes parties. Dans une première partie nous avons caractérisé le modèle d’étude de cellules U937 traitées avec l’association PMA/LPS (U937 PMA/LPS) afin de préciser les effets propres de chacun des activateurs. Pour cela, nous nous sommes intéressés aux principales étapes de la cascade métabolique de l’acide arachidonique et des enzymes clés (PLA2, COX-2). Au-delà des
eicosanoïdes, nous avons également caractérisé les cytokines produites dans le modèle ainsi que le niveau d’activation des facteurs de transcription Nrf2 et NF-κB.
Dans une deuxième partie des résultats nous avons disséqué les mécanismes d’action des sensibilisants conduisant à l’inhibition de la production de PGE2 observée. Ce travail s’est
focalisé sur six sensibilisants de référence de potentiels variés : le 1-chloro-2,4- dinitrobenzene (DNCB), le 1,4-dihydroquinone (HQ), la 1,4-para-phenylenediamine (PPD) et le n-propyl gallate (PG), en tant que sensibilisants extrêmes/forts, le cinnamaldehyde (CIN) en tant que modéré et l’eugenol (EUG) en tant que sensibilisant faible. De plus, la diversité des mécanismes de réaction est représentée au sein de notre set puisque le DNCB et le CIN sont des haptènes vrais, la PPD, l’HQ et le PG des pré-haptènes tandis que l’EUG est un pro-haptène. Cette partie se présente sous la forme d’un article paru dans « Toxicology and Applied Pharmacology » et de résultats complémentaires.
molécule, en évaluant un set d’environ 170 molécules. Dans la troisième partie des résultats, sont détaillés les résultats du test, la définition de son modèle prédictif ainsi que l’analyse statistique de ses performances. Enfin, nous avons initié une réflexion sur le positionnement relatif du test PGE2 par rapport aux autres tests in vitro DPRA, MUSST et Nrf2, utilisés en