Les*objectifs*de*la*thèse*

Les! projets! de! recherche! portés! par! l’équipe! Virologie<Vection! de! Colmar! portent! (i)! sur!

l’étude!de!la!biologie!d’un!virus!très!dommageable!pour!la!vigne!(le!virus!du!court!noué!ou!

GFLV,! népovirus),! (ii)! sur! les! différentes! méthodes! de! lutte,! biotechnologiques,!

conventionnelles!ou!par!prémunition,!contre!les!viroses!majeures!de!la!vigne!et!(iii)!sur!les!

mécanismes!de!transmission!des!virus!par!des!vecteurs.!Dans!le!cadre!de!ce!dernier!objectif,!

plusieurs! projets! sont! développés! sur! l’étude! de! la! biologie! de! la! vection! des! virus! de!

l’enroulement! de! la! vigne! par! les! cochenilles,! l’étude! des! mécanismes! moléculaires! de! la!

transmission! des! népovirus! de! la! vigne! par! nématodes! et! enfin! l’étude! du! dialogue!

plante/polérovirus/puceron.!C’est!dans!le!cadre!de!cette!dernière!thématique,!dirigée!par!

Mme!Véronique!Brault,!que!j’ai!effectué!ma!thèse.!L’étude!des!interactions!entre!la!plante,!

les!polérovirus!et!les!pucerons!est!développée!à!l’heure!actuelle!selon!deux!axes!majeurs.!Le!

premier!consiste!à!analyser!les!modifications!induites!par!le!virus!dans!les!plantes!infectées!

qui!peuvent!avoir!un!impact!sur!les!pucerons!et!donc!agir!sur!la!transmission!du!virus.!Le!

deuxième!axe!porte!sur!la!recherche!et!l’identification!des!récepteurs!des!polérovirus!chez!

les! pucerons.!L’ensemble! de! ces! travaux! est! mené! afin! d’identifier! de! nouvelles! cibles!

moléculaires!pour!lutter!contre!ces!virus!et!leur!transmission!par!puceron.!Mes!travaux!de!

thèse! se! sont! insérés! dans! la! thématique! de! la! recherche! des! récepteurs! des! polérovirus!

chez!les!pucerons!en!utilisant!le!pathosystème!Myzus/persicae//!polérovirus!/!Arabidopsis/

thaliana./

Partant! des! connaissances! acquises! sur! le! rôle! essentiel! des! protéines! structurales! des!

polérovirus! dans! la! transmission! par! puceron,! des! cribles! double! hybride! dans! la! levure!

d’une!banque!de!cDNA!totale!de!M./persicae!en!utilisant!les!CP!et!RT*!du!CABYV!et!du!TuYV!

comme!appâts!avaient!été!réalisés!par!un!post<doctorant!au!laboratoire,!Baptiste!Monsion!

(2008! à! 2012).! Cette! analyse! a! permis! d’identifier! les! protéines! ALY! (crible! avec! la! CP! du!

TuYV)!et!Eph!(crible!avec!la!RT*!du!CABYV!et!du!TuYV)!comme!protéines!candidates!pour!la!

fonction!de!récepteur!viral!du!des!polérovirus.!

L’objectif!de!cette!thèse!était!de!confirmer!l’implication!de!la!protéine!Ephrin/Receptor!(Eph)!

et!de!la!protéine!ALY!du!puceron!dans!la!transmission!des!polérovirus.!ALY!est!une!protéine!

nucléaire!et!nucléolaire!intervenant!dans!des!modifications!des!ARN!(maturation!des!ARN!

ribosomiques,! épissage! des! mRNA)! et! dans! le! transport! des! mRNA! du! noyau! vers! le!

cytoplasme.!La!protéine!Eph!est,!quant!à!elle,!une!protéine!membranaire!qui!est!impliquée!

dans! les! communications! cellulaires! et! également! dans! l’endocytose.! Cette! protéine! était!

donc!un!bon!candidat!pour!être!impliquée!dans!l’accrochage!et!l’internalisation!du!virus.!Il!a!

récemment!été!montré!que!certains!virus!infectant!les!mammifères!utilisent!des!protéines!

de!la!famille!des!récepteurs!de!l‘éphrine!comme!un!récepteur!permettant!l’internalisation!

des!virus!(voir!chapitre!2!de!la!thèse,!Analyse!de!l’implication!des!gènes!Eph!et!ALY!dans!la!

transmission! virale! des! polérovirus! à! l’aide! de! méthodes! d’ARN! interférence).! Les! travaux!

d’interaction! dans! la! levure! ont! été! poursuivis! par! Sylvaine! Boissinot! (Ingénieure)! au!

laboratoire!qui!a!montré!que!les!protéines!de!structure!du!TuYV!se!liaient!également!à!la!

protéine! Eph.! Ce! virus,! plus! facilement! manipulable! que! le! CABYV! a! été! choisi! pour!

poursuivre!les!expériences!de!validation!fonctionnelle!chez!le!puceron.!

Ces! travaux! de! validation! fonctionnelle! des! candidats! ont! été! amorcés! par! Baptiste!

Monsion,!puis!poursuivis!par!Maryam!Rastegar!(étudiante!iranienne!en!thèse)!dans!le!cadre!

d’un!séjour!de!10!mois!au!laboratoire!(mars<décembre!2013).!Ces!expériences!de!validation!

fonctionnelle,! basées! sur! l’utilisation! du! RNAi,! consistaient! à! produire! dans! des! plantes!

transgéniques!des!structures!ARN!en!tige<boucle!(hpRNA)!ciblant!le!gène!candidat!dans!le!

puceron.! Les! premières! expériences! d’ingestion! de! ces! molécules! d’ARN! interférence!

produites!dans!la!plante,!ont!permis!d’inhiber!l’expression!du!gène!Eph!chez!le!puceron!et!

de!réduire!la!transmission!du!!TuYV!lorsque!celui<ci!était!acquis!à!partir!d’une!solution!de!

virus!purifié.!Ces!premiers!éléments!semblaient!montrer!que!le!gène!Eph!est!directement!

impliqué!dans!le!processus!de!transmission!du!TuYV.!!

Le!projet!initial!proposé!dans!le!cadre!de!cette!thèse!était!de!poursuivre!la!caractérisation!

des!candidats!identifiés!précédemment!dans!l’équipe,!et!notamment!la!protéine!Eph,!afin!

de! préciser! leur! rôle! dans! le! processus! de! transmission! des! polérovirus! par! puceron.!

Cependant,!l‘utilisation!des!générations!suivantes!des!plantes!transgéniques!exprimant!des!

dsRNA!ciblant!le!gène!Eph!n’a!pas!permis!d’obtenir!à!nouveau!l’inhibition!de!l’expression!de!

ce! gène,! ni! l’inhibition! de! la! transmission! du! virus.! Nous! avons! donc! du! rechercher! une!

nouvelle! méthode! basée! sur! le! RNAi! pour! poursuivre! la! validation! fonctionnelle! des!

candidats.! En! raison! de! la! faible! reproductibilité! des! résultats! émanant! des! expériences!

d’ARN!interférence!chez!le!puceron,!ces!expériences!ont!du!être!reproduites!de!nombreuses!

fois!afin!d’obtenir!des!résultats!robustes.!Nous!avons!ainsi!dû!réviser!les!objectifs!initiaux!de!

la! thèse! à! la! baisse,! et! le! candidat! ALY! n’a! été! que! peu! étudié! pendant! ma! thèse.! Mes!

travaux!ont!donc!consisté!à!mener!une!analyse!comparative!de!différentes!méthodes!d’ARN!

interférence! appliquées! au! puceron!M./ persicae! en! utilisant! les! gènes!ALY! et!Eph/comme!

gènes! cibles.! Le! développement! de! certaines! de! ces! méthodes! nous! a! ensuite! permis! de!

valider!l’implication!du!gène!Eph/dans!la!transmission!du!TuYV,!et!de!l’identifier!comme!un!

récepteur!potentiel!de!ce!virus!chez!M./persicae.!

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Chapitre(1(:(Méthodes(de(validation(fonctionnelle(des(gènes(

de(puceron(:(état(de(l’art(et(étude(comparative(de(plusieurs(

méthodes(basées(sur(l’ARN(interference(chez(le(puceron(

Myzus$persicae(

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