1. Introduction
1.5. Objectifs de la thèse
Le ribozyme VS de Neurospora possède un mode de reconnaissance de son substrat unique parmi les petits ribozymes nucléolytiques et cette reconnaissance autant que la formation de son site actif mettent en jeu la dynamique de sous-domaines riches en interactions secondaires et tertiaires. Ces particularités le rendent à la fois intéressant comme modèle pour l’explorations
des relations entre structure, dynamique et fonctions des ARN catalytiques et comme cible d’ingénierie. L’hypothèse de travail initiale était la suivante : la fonction du ribozyme VS repose sur un ensemble de paramètres structuraux et dynamiques finis qui, une fois connus, peuvent être modifiés rationnellement afin d’altérer la reconnaissance et le clivage de son substrat par le ribozyme. Nous avons donc cherché à en savoir plus à la fois sur sa structure tridimensionnelle et ses capacités dynamiques ainsi que sur son potentiel d’ingénierie.
Ces objectifs ont été remplis en suivant un protocole en trois étapes :
Premièrement, il a été nécessaire de démontrer que notre modèle, le ribozyme VS de Neurospora, pouvait être modifié sans perdre totalement sa structure et sa fonction. Il était important également d’en connaitre plus sur sa conformation active puisqu’aucune structure complète à haute résolution du ribozyme VS n’était publiée à ce moment-là. Notre hypothèse pour ce premier article était la suivante : dans le modèle initial de l’interaction boucle-boucle, l’hélice I du substrat est positionnée de manière colinéaire par rapport à l’hélice V du ribozyme. Par conséquent, il devait être possible de retrancher des paires de bases à l’une de ces hélices pour allonger l’autre d’autant sans supprimer la fonction. Nous avons donc mis au point un procédé pour caractériser systématiquement la cinétique de combinaisons de ribozymes et de substrats présentant des hélices V et I de différentes longueurs. Nous avons ensuite produit différents modèles de l’interaction boucle-boucle compatibles avec les données biochimiques connues à ce moment-là puis, par comparaison statistique entre les critères structuraux de ces modèles et les données de cinétiques, nous avons sélectionné les modèles compatibles avec les activités observées. Ces travaux ont permis de déterminer que le ribozyme VS possède la capacité de reconnaitre et cliver des substrats de longueurs différentes. Ils ont également permis de caractériser le phénomène de compensation de longueur d’hélice, par lequel des ribozymes dont les hélices sont allongées ou raccourcies peuvent cliver des substrats dont la longueur les rendaient non clivables par le ribozyme naturel. Les modèles de l’interaction kissing-loop sélectionnés par l’analyse statistique semblaient enfin indiquer qu’un angle proche de 165° entre les axes des hélices I et V expliquait au mieux les données cinétiques.
Ensuite, nous avons cherché à pousser plus loin la modification du ribozyme en modifiant un élément de structure tertiaire crucial à la reconnaissance de son substrat, l’interaction boucle-boucle I/V, dans l’idée de lui permettre d’accommoder et de cliver d’autres
substrats repliés tige-boucles. Dans cette optique, nous avons effectué une recherche d’interactions boucle-boucle de taille similaires dans la base de données RCSB puis nous avons filtré les candidats sur des critères structuraux afin de garder ceux dont les angles interhélicaux entre les hélices leur étant rattachées étaient compatibles avec les angles observés dans l’ensemble de conformations de l’interaction naturelle obtenu par RMN. Les cinétiques de ribozymes mutants pourvus des interactions alternatives ont été testées in vitro puis ont été structuralement caractérisés dans le contexte de la structure cristalline publiée peu de temps auparavant. Les deux candidats retenus pour la substitution, soit l’interaction TAR/TAR* du VIH et l’interaction L22/L88 du ribosome de D. radiodurens ont démontré une activité de clivage substantielle, quoique 50-160 fois moindre que celle du ribozyme porteur de l’interaction naturelle.
La caractérisation structurale entreprise dans l’article précédent n’ayant pas permis d’expliquer l’activité plus basse des variantes, nous avons cherché à relier à la dynamique intrinsèque des différents complexes boucle-boucle à l’activité du ribozyme naturel et de ses variantes, selon l’hypothèse que, la dynamique du reste du ribozyme étant égale par ailleurs, ce paramètre était principalement responsable de la différence d’activité observée précédemment. Les espaces conformationnels des variantes de l’interaction ont été caractérisés par des expériences de temperature-replica exchange molecular dynamics associées à une analyse en dynamique essentielle. Ces protocoles nous ont permis de détailler la dynamique des trois complexes étudiés en leurs modes de mouvement essentiels, de comparer leurs espaces conformationnels et d’identifier les résidus impliqués dans leur dynamique. Ces travaux ont montré une différence importante entre les espaces conformationnels explorés par les trois interaction kissig-loop étudiées, différence due en partie à la disponibilité de résidus libres dans l’interaction boucle-boucle naturelle. Afin de confirmer l’importance de ces résidus libres, nous avons effectué une expérience de sélection in vitro visant à obtenir un ribozyme doté d’une boucle V modifiée, capable de reconnaitre et cliver efficacement un substrat doté de la boucle de TAR. Les résultats de cette sélection ont révélé des interactions kissing-loop possédant moins de paires de base que l’interaction TAR/TAR* originale et dotées de capacités dynamiques intrinsèques se rapprochant de celles de l’interaction I/V.
De la manipulation de quelques paires de base à l’observation atomistique de la dynamique d’une interaction tertiaire cruciale, nous avons exploré le potentiel d’ingénierie du ribozyme VS de Neurospora au travers de ses structures et de sa dynamique à haute résolution. Ces données nous ont permis de bâtir un cadre théorique pour une meilleur appréhension de la fonction du ribozyme et, par extension, des ARN catalytiques.