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III-1. Objectifs de recherche
Comme présenté dans les chapitres précédents, les modifications sulfatées des positions 4 ou 6 des D-galactoses de la zone de liaison peuvent avoir lieu lors de la biosynthèse des protéoglycanes mais leur rôle n’est pas encore bien déterminé, notamment sur les enzymes de bifurcation. De nombreuses études ont montré la synthèse totale ou partielle de la zone de liaison, sulfatée sur au moins l’un des D-galactoses. Mais très peu d’études reportent la synthèse de composés disaccharidiques sulfatés de la zone de liaison possédant la première unité des CS/DS ou des Hep/HS. De plus, très peu de résultats biologiques associés à ces différentes synthèses sont publiés sur la CSGalNAcT-1 et l’EXTL2 ou l’EXTL3.
Dans le cadre d’un projet ANR « GAG-sorting » en collaboration avec l’équipe de biologistes du Dr. Sylvie Fournel-Gigleux de l’université de Lorraine, nous nous sommes intéressés au comportement de deux enzymes de bifurcation, la CSGalNAcT-1 et l’EXTL3, vis-à-vis de composés sulfatés. En effet, cette équipe avait montré que des trisaccharides D- GlcA-D-Gal-D-Gal de la zone de liaison étaient substrats de la CSGalNAcT-1 et que les composés sulfatés en position 4 ou 6 du Gal-1 ou en position 6 du Gal-2 étaient meilleurs substrats que leurs analogues non sulfatés. De plus aucune activité n’était observée avec le trisaccharide sulfaté en position 4 du Gal-2.45
L’objectif de ce travail de thèse est donc la synthèse de disaccharides de la zone de liaison, dont le motif sera D-GlcA-β-(1→3)-D-Gal, sulfatés en position 4 ou 6 du D-galactose, afin, d’une part, de voir si ce motif disaccharidique est suffisant pour être substrat de la CS- GalNAcT-1 et de l’EXTL3 et d’autre part d’étudier le rôle des sulfates sur ces deux enzymes. Ces composés possèderont un groupement encombrant UV-visible en position anomérique, le motif 2-naphtylméthyle (NAP), afin de faciliter leur détection lors des tests biologiques. Les différentes molécules 128-130 seront donc synthétisées (Figure 9).
Figure 9 : Disaccharides cibles
Afin d’interpréter de manière non ambigüe les résultats des tests biologiques, les produits de transfert 131-136, qui sont des trisaccharides possédant le motif disaccharidique précédent attaché au premier motif aminé des deux types de GAGs (D-GalNAc et D-GlcNAc),
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Figure 10 : Trisaccharides cibles
Ces produits de transfert pourront également être testés, dans un projet futur, sur les enzymes d’élongation des chaines de CS et de HS afin d’étudier le rôle des sulfatations sur celles-ci.
Toutes ces synthèses seront présentées au chapitre IV.
Dans un deuxième temps, nous nous intéresserons à la sulfatation des sucres, et nous avons envisagé, en collaboration avec l’équipe du Professeur Sylvain Routier et du Docteur Frédéric Buron (ICOA), de tester de nouvelles méthodes d’activation pour ces réactions, à savoir le micro-ondes et la chimie en flux continu, pour effectuer la 6-sulfatation régiosélective, la sulfatation de la position 4 ou encore la 4,6-disulfatation.
Dans le même esprit, nous avons envisagé d’utiliser des sulfatases afin de désulfater des composés 4,6-disulfatés, pour obtenir les composés monosulfatés correspondants, en collaboration avec le Professeur Richard Daniellou et le Docteur Pierre Lafite (ICOA).
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III-2. Stratégie de synthèse pour accéder aux di- et
trisaccharides sulfatés
Notre stratégie de synthèse repose sur une synthèse convergente avec la préparation du disaccharide 137, commun à toutes les molécules finales (Figure 11).
Figure 11 : Précurseur 137
Ce disaccharide possède un groupement NAP en position anomérique, un groupement silylène sur les positions 4 et 6 du D-Gal, qui pourra être sélectivement déprotégé pour les sulfatations futures, et un groupement protecteur temporaire lévulinoyle qui permettra l’accès aux trisaccharides.
Ce disaccharide 137 provient de la glycosylation entre deux monosaccharides, le bloc donneur 82 et le bloc accepteur 138. Le composé 82, dont la synthèse est déjà connue au laboratoire,55 possède des groupements permanents Bz et un groupement temporaire Lev. L’acide carboxylique est quant à lui protégé sous forme d’ester méthylique. Ce composé est activé par un imidate pour permettre la glycosylation. Le monosaccharide 138 possède également un Bz comme groupement permanent, un silylène sur les positions 4 et 6 et le groupement NAP en position anomérique ; la position 3 reste libre pour pouvoir effectuer la glycosylation (Schéma 23).
57 Les différents trisaccharides comportant la première unité des CS 131-133 et ceux comportant la première unité des HS 134-136 seront obtenus à partir du disaccharide 137, dont le groupement Lev sera sélectivement déprotégé, et des différents monosaccharides 111 et 139 respectivement (Schéma 24).
Schéma 24 : Rétrosynthèse des trisaccharides 131-136
La D-GalN 111, qui est la première unité des CS, est protégée par des groupements acétates sur les positions 3, 4 et 6, l’amine de la position 2 est protégée par un groupement trichloroacétate (TCA) et la position 1 est activée par un trichloroacétimidate.
La D-GlcN 139, qui est la première unité des HS, est protégée par des groupements acétates sur les positions 3, 4 et 6 et possède un groupement azido N3 sur la position 2 comme
précurseur d’amine. La position 1 est, quant à elle, activée par un trichloroacétimidate.
Le choix de ces deux groupements différents en position 2 s’explique par la sélectivité souhaitée. En effet, lors de la glycosylation, si l’anomérie 1,2-trans est souhaitée, un groupement participant (du type ester, amide, thioester) est nécessaire en position 2 du sucre donneur afin d’avoir l’assistance anchimérique. Pour une anomérie 1,2-cis un groupement non participant (azido, éther) doit être utilisé (Schéma 25). Pour les trisaccharides 131-133, l’anomérie 1,2-trans, ici β, étant souhaitée, un groupement participant amide est donc nécessaire sur la position 2 du composé 111. Dans notre synthèse, le groupement trichloroacétamide sera utilisé car il a été montré que cela permettait d’avoir de bons rendements de glycosylation avec une très bonne sélectivité 1,2-trans.60 En revanche, pour les trisaccharides 134-136, la sélectivité 1,2-cis, ici α, étant voulue, un groupement non participant comme le groupement azido sera utilisé.
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Schéma 25 : Mécanismes de glycosylation
Tous les donneurs utilisés dans nos synthèses seront activés par des trichloroacétimidates. En effet, bien qu’il existe différentes méthodes pour préparer des composés activés, les trichloroacétimidates de Schmidt66 semblent les plus utilisés. Ces derniers sont obtenus à partir des hémiacétals des sucres correspondant et le groupement activateur est introduit en présence de trichloroacétonitrile (Cl3CCN) et d’une base (Schéma
26). La base utilisée permet le contrôle de l’anomérie α/β. L’anomère β est le composé
cinétique et l’anomère α est le produit thermodynamique. L’utilisation d’une base encombrée comme la 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ène (DBU) permet d’obtenir majoritairement une anomérie α.
Schéma 26 : Formation du trichloroacétimidate de Schmidt
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62 Dans ce chapitre, nous décrirons dans un premier temps la synthèse du disaccharide clé 137, puis la synthèse des différents composés sulfatés et enfin celles des différents trisaccharides, possédant la première unité des CS ou celle des HS.