Ce travail de thèse s’inscrit dans la lignée des recherches au sein du laboratoire, à savoir la mise au point de nouvelles thérapies dans le traitement des désordres immunitaires. L’utilisation de VLP) comme vecteur de signal de tolérance exploite le savoir-faire préexistant de l’équipe au sein de la structure tout en apportant un caractère hautement novateur en s’éloignant des applications vaccinales conventionnelles. Les objectifs initiaux de ce projet étaient multiples : (i) développer la production de VLP vectorisant un antigène par l’intermédiaire d’une fusion avec les protéines de capside mais également d’y adjoindre un signal immunorégulateur par l’intermédiaire de protéines de surface. Le CTLA-4 est à notre sens un candidat intéressant justifié par un réel recul d’utilisation dans de nombreuses MAI chez la souris et chez l’Homme et dans la possibilité de développer de nombreux tests de caractérisation et de comparaison grâce aux outils préexistants. (ii) évaluer cette thérapie sur les cellules cibles et mesurer la capacité à inhiber des réponses antigènes spécifiques et/ou induire des acteurs de la tolérance, (iii) définir l’efficacité dans des modèles murins de pathologies. Dans ce cadre, l’allergie alimentaire représente une pathologie intéressante car définie par une physiopathologie causée par des allergènes (antigènes) parfaitement caractérisés mais aussi par une exacerbation des réponses lymphocytaires Th2. Le choix de l’allergie alimentaire, pour laquelle peu de solutions existent, permet également l’action de ces VLP en utilisant des modèles d’allergies croisées. (iv) caractériser les acteurs et les mécanismes de l’établissement de la tolérance immunitaire. Au-delà de l’utilisation des VLP tolérogènes dans l’allergie alimentaire, l’objectif in fine de ce projet est d’entrevoir la possibilité de translation de cette thérapie dans le domaine des MAI.
Production et caractérisation des VLP
La production des VLP a été réalisée selon les mêmes procédés que ceux présentés dans plusieurs travaux de recherches publiés (Garrone et al., 2011a; Pitoiset et al., 2017). Par l’intermédiaire de cellules productrices humaines de type HEK293T, les VLP ont été générées par transfection de plasmides codant pour les protéines Gag ou Gag-Pol, les protéines de fusion Gag-eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) et Gag-OVA ainsi que pour les différentes molécules natives ou chimériques de CTLA-4. Ce recours à des
expression de cette molécule causée par un signal de rétention intracellulaire présent dans la partie intra-cytoplasmique. La purification de ces particules s’est opérée à l’aide d’ultracentrifugation sur gradient de densité et a précédé la quantification et la caractérisation des constituants ainsi que la validation des lots produits. Ces dernières étapes ont été réalisées entre autres par technique de dosage BCA, ELISA, Western-Blot et par cytométrie en flux.
Étude d’efficacité des VLP tolérogènes sur les cellules cibles
Afin d’étudier le potentiel tolérogène de ces VLP, des expériences de coculture avec des DC ont été réalisées et ont permis une étude du phénotype de ces cellules en conditions activatrices ou non. Dans le but de renforcer les données obtenues, nous avons également réalisé ces analyses avec d’une part des DC issues de la rate et d’autre part des DC différenciées à partir de la moelle osseusse. Enfin, pour permettre d’envisager dans le futur un développement chez l’Homme, ces expériences ont été reproduites avec des DC dérivées de monocytes sanguins humains. Quelle que soit la condition, les analyses effectuées ont consisté en l’analyse du phénotype et de la sécrétion cytokinique ou enzymatique de ces cellules par cytométrie en flux et par quantification ELISA des surnageants de culture. La conséquence de cette modulation des DC est illustrée par les capacités d’inhibition de prolifération spécifique d’un antigène. Cette étude a été réalisée in vitro par la coculture de LyT et d’APC issues de souris ayant un TCR spécifique pour l’ovalbumine (souris OT-II).
Efficacité des VLP tolérogènes dans un modèle murin d’allergie alimentaire à l’ovalbumine
L’utilisation du modèle d’allergie alimentaire présente de nombreux avantages pour répondre à la question de la pertinence des VLP tolérogènes dans les désordres immunitaires et notamment celui d’avoir déjà été utilisé au sein du laboratoire dans la recherche de nouvelles thérapies immunorégulatrices (Bonnet et al., 2016). Dans le cadre de nos recherches, nous avons choisi d’administrer les VLP tolérogènes chez des souris sensibilisées à l’allergène et avant le développement des symptômes cliniques. La dose
ainsi que le schéma d’administration utilisé ont été relativement empiriques en s’appuyant essentiellement sur les données obtenues avec l’utilisation de VLP en vaccination classique. Par la suite, l’évaluation de la sévérité de la maladie s’est appuyée sur les travaux déjà publiés avec l’évaluation clinique des animaux (aspect du poil, présence ou absence de diarrhées, température corporelle), mais également par des critères biologiques (e.g. taux sériques d’IgE, d’IgG2a, metalloprotéases). La mise en lumière des acteurs impliqués in vivo dans la protection a été réalisée par le transfert de LyT régulateurs issus de souris traitées ou non par des VLP tolérogènes. Ces cellules ont ensuite été injectées à des souris naïves qui furent sensibilisées et challengées successivement. En dernier lieu, et pour répondre aux interrogations sur la spécificité d’action de ces nanoparticules, un modèle croisé d’allergie à l’ovalbumine et à la cacahuète a été mis au point.