Objectifs

Les nanovecteurs sont un important champ de recherche, un nouveau mode d’ad-ministration de médicaments. Nous nous préoccuperons dans ce travail de deux questions, l’encapsulation des médicaments dans des nanovecteurs individuels, et le contrôle de la libération de la charge médicamenteuse.

Pour étudier la première question, nous utiliserons des émulsions constituées d’un cœur huileux et d’une couronne aqueuse stabilisées pas des tensioactifs. Pour la seconde question, nous utiliserons un système ultrasonore qui a pour but de dé-clencher l’échantillon pour libérer le médicament encapsulé à l’intérieur.

A.4.1 Nanovecteur : Émulsion chargée en médicament

Les nanoémulsions (NEs) sont des systèmes métastables comportant au moins deux phases liquides non miscibles, en général l’eau et l’huile, dispersées l’une dans l’autre sous forme de gouttelettes sphériques de 20 à 200 nm de diamètre. Les NEs ont été développées depuis une quinzaine d’années grâce à l’amélioration de la compréhen-sion des méthodes d’émulsification à basse énergie et la disponibilité des techniques d’émulsification à haute énergie. Les NEs ont alors suscité un intérêt grandissant, spécialement durant la dernière décennie, dans différents domaines tels que la chi-mie, les sciences des matériaux et les sciences pharmaceutiques et médicales. Dans le domaine pharmaceutique, les NEs ont été développées pour améliorer la délivrance des substances actives (SAs). Les NEs huile dans l’eau permettent de solubiliser les SAs hydrophobes peu ou pas solubles dans l’eau. Leur surface spécifique accrue par rapport aux émulsions conventionnelles permet une meilleure libération de la substance active (SA) et, en conséquence, améliore leur biodisponibilité. Les NEs peuvent également améliorer la stabilité chimique des SAs sensibles aux dégrada-tions enzymatiques et chimiques.

A.4.2 Préparation des émulsions

Un microfluidiseur haute pression (LV1 de Microfluidics) a été utilisé pour produire des nanogouttelettes, avec un diamètre moyen de 100 nm ainsi qu’une faible po-lydispersité plus petite. Cet appareil nécessite une solution pré-émulsionnée. Dans mon cas, la pré-émulsion ou une émulsion grossière a été obtenue en mélangeant tous les constituants. Ensuite, l’émulsion grossière a été transférée dans une seringue reliée à un tube d’entrée du microfluidiseur. On remplit la chambre du microfluidi-seur avec 2 ml de l’échantillon. Ensuite, un piston force tout le volume d’échan-tillon à passer à travers une chambre microfluidique à haute pression. Dans notre cas, la chambre microfluidique est une chambre en forme de Y (modèle F12Y, di-mension intérieure de 75 mm) dont la forme induit un impact entre les suspensions de gouttelettes s’écoulant à un taux de cisaillement élevé l’une vers l’autre, ce qui entraîne la rupture des gouttelettes en gouttelettes plus petites. L’échantillon est fi-nalement recueilli dans une autre seringue reliée au tube de sortie. Un échange des seringues permet de refaire passer l’échantillon à travers le système de microflui-diseur. À chaque passage, la taille des gouttelettes et la polydispersité diminuent. Nous avons déterminé que le nombre optimal de passages était de huit.

90 Annexe A. Résumé en Francais

Deux types des émulsions a été utilisé lors de cette étude : 1. Émulsion chargée en Paclitaxel (médicament anticancéreux) 2. Émulsion chargée en lévofloxacine (antibiotiques)

A.4.3 1er objectif : Émulsion chargée en Paclitaxel

Pour atteindre notre premier objectif d’encapsuler le médicament anticancéreux « Paclitaxel », on a préparé des émulsions en utilisant le bromure de perfluorooctyl (PFOB) (95% v/v) comme phase aqueuse et le tributyl O-acétyle citrate (5% v/v) comme phase huileuse, et tout le contenu était dissous dans du chlorure de sodium 0.9%.

Ces émulsions sont stabilisées par un tensioactif fluoré biocompatible récemment breveté.

Pour charger les émulsions en Paclitaxel, le Paclitaxel doit être solubilisé en tri-butyl O-acétyle citrate avant de produire l’émulsion.

Après avoir mélanger tout le contenu en utilisant le vortex, on fait passer l’émul-sion dans l’homogénéisateur à une presl’émul-sion de 20000 psi. Une fois les émull’émul-sions préparées, on mesure leur taille par la méthode de diffusion de lumière (DLS) pour s’assurer que leur taille se situe entre 150 et 300 nm.

Pour tester l’efficacité de ces émulsions chargées en Paclitaxel, on a utilisé des cellules cancéreuses du colon CT-26. 3 types d’expériences ont été réalisés pour ce but :

1. étudier la toxicité des ultrasons à basse pression sur les cellules.

2. étudier la toxicité des émulsions non chargées de médicaments sur les cellules insonifiées par les ultrasons.

3. étudier l’efficacité des émulsions chargées de Paclitaxel et insonifiées par les ultrasons à basse pression.

A.4.3.1 Résultats

Nos nanovecteurs permettent la délivrance en utilisant des pressions crête à crête correspondant à des pressions négatives maximales de PNP = 0.2 et 1.75 MPa des indices mécaniques (MI) de 0.2 et 1.7, respectivement. Cela signifie que nos vecteurs sont compatibles avec l’utilisation d’échographes cliniques et se situent dans des normes ultrasoniques sûres. Parce que le temps d’insonification doit durer plusieurs minutes, l’approche est plus adaptée pour traiter des tissus tumoraux où des nano-gouttelettes se sont accumulées en raison de ciblage actif ou passif.

Le mécanisme de relargage n’est ni lié à la cavitation ni à la vaporisation acous-tique des gouttelettes, mais probablement en raison de la perméabilisation accrue de l’enveloppe des nanogouttelettes coquille induite par la force d’insonification ul-trasonore.

FIGUREA.2 – Viabilités des cellules CT-26 mesurées à 24 h (cercles) et 48 h (carrés) après avoir été insonifiées ou incubées pendant un temps

τà 37 °C en absence d’émulsion (figure du haut), en présence d’émul-sion (φ= 0.0058%) dépourvue de paclitaxel (figure du milieu), et en

présence d’émulsion (φ = 0.0058%) encapsulant le paclitaxel (figure

du bas). Les symboles gris ( et) sont pour les solutions de cellules CT-26 incubées pendant un temps τ (sans ultrason ni émulsion), pour les solutions CT-26 incubées pendant (τ) en présence d’émulsion sans ultrasons ( et) ou insonifiées pendant τ à une pression de 0,4 MPa

92 Annexe A. Résumé en Francais

A.4.4 2ème objectif : Émulsion chargée en lévofloxacine

Pour tester le relargage du lévofloxacine sur un site d’infection bien localisée, on a préparé un deuxième type d’émulsion formée uniquement avec 95% cœur huileux de tributyl O acétyle citrate, en ajoutant du Suppocirer_{A et en stabilisant cette}

émul-sion avec du tensioactif H₁₂TAC₇, le tout dans du chlorure de sodium 0.9%, pour ob-tenir à la fin des émulsions de la taille de 284 nm (mesurées par diffusion de lumière (DLS)) préparées par l’homogénéisateur LV1. L’efficacité des émulsions chargées du lévofloxacine a été testées sur les bactéries en suspension E. coli, et comme pour le médicament anticancéreux, 3 types d’expériences ont été faits :

1. Étudier la toxicité des ultrasons à basse pression sur les bactéries .

2. Étudier la toxicité des émulsions non chargées de médicaments sur les bacté-ries insonifiées par les ultrasons.

3. Étudier l’efficacité des émulsions chargées de lévofloxacine et insonifiées par les ultrasons a basse pressions.

A.4.4.1 Résultats

FIGUREA.3 – Comparaison des bactéries viables récupérées après so-nication à des pressions acoustiques différentes (vert (sans FUS), bleu (0.4 MPa), orange (3.5 MPa)). L’axe des x représente la concentration de l’émulsion et l’axe des y est le taux de survie d’E. coli (%). (A) ex-périences réalisées en utilisant une émulsion dénuée. (B) exex-périences

Nous avons développé un nanovecteur sonosensible pour la lévofloxacine. Le vecteur dépourvu de lévofloxacine ne présente aucune toxicité vis-à-vis d’ E. coli. Alors que le vecteur chargé de lévofloxacine montre un effet contre E. coli dû soit à une libération passive de lévofloxacine ou après un déclenchement ultrasonore.

Le pic des pressions acoustiques maximales utilisées dans cette étude corres-pondent à un indice mécanique de 0.2 et 1.7 pour P_pkpk= 0.4 et 3.5 MPa, respective-ment, la valeur maximale autorisée est 1.9 en échographie clinique. Ainsi, ce porteur sonosentive peut potentiellement être utilisé avec un échographe clinique. Ce travail a conduit à l’obtention d’un brevet chez SATT SUD EST.