L’étude du rôle des protéines kinases de la famille « Aurora » dans la régulation du cycle cellulaire a intéressé le Dr Claude Prigent depuis plus d’une décennie. Ainsi, son équipe de recherche « Cycle Cellulaire » a participé activement à la connaissance de cette famille de kinase, et ce dès après la découverte de la première protéine kinase « Aurora » chez la drosophile par l’équipe de Glover (Glover et al., 1995). Plus particulièrement, la kinase Aurora-A a fait l’objet de nombreuses publications de la part de cette équipe (Giet and Prigent, 1998 ; Giet and Prigent, 1999 ; Giet et al., 1999a ; Giet et al., 1999b ; Giet and Prigent, 2000 ; Giet and Prigent, 2001 ; Giet et al., 2002 ; Prigent and Giet, 2003 ). Cependant, ces résultats très intéressants, tout comme ceux d’autres équipes qui s’intéressaient à l’étude de la kinase Aurora-A ont porté sur le rôle de cette kinase dans les premières phases de la mitose.
Force est de reconnaître que les méthodes d’étude de la kinase au cours du cycle cellulaire jusque-là disponibles ne permettaient pas d’explorer ces fonctions dans les phases tardives de la mitose. En fait, l’inhibition de la kinase Aurora-A empêche la formation du fuseau bipolaire avec comme conséquence l’impossibilité d’investiguer au-delà de cette étape et des autres étapes ultimes de la mitose (transition métaphase/anaphase et cytokinèse). C’est ainsi que, pour contrecarrer cette insuffisance, le Dr Claude Prigent a mis en place le projet Aurora-A Shokat en collaboration avec le Dr Kevan Shokat de l’université de Californie. Cette
chimique » permettant d’étudier, in vivo, le rôle de la kinase Aurora-A dans les dernières phases de la mitose. Cette approche consiste à muter une kinase (AS, allele sensitive) de façon à la rendre sensible à un inhibiteur spécifique, qui n’a pas d’autres cibles dans la cellule. Cet inhibiteur (1-Na-PP1) inhibe très rapidement, et spécifiquement la kinase Aurora-A (AS) à des moments très précis du cycle cellulaire. Avant mon arrivée au laboratoire, le Dr Claude Prigent et son équipe avaient établi des constructions de lignées cellulaires stables exprimant la kinase mutée Aurora-A (AS) sous la dépendance d’un promoteur endogène ayant un tag GFP.
Ainsi, mon projet de thèse a été d’étudier, en utilisant le couple kinase Aurora- A (AS) et son inhibiteur spécifique, les rôles potentiels de la kinase Aurora-A dans les phases tardives de la prométaphase, et de poser la question d’une implication de Aurora-A dans le SAC (Spindle aseembly Checkpoint). Pour ce faire, j’ai mis en place un protocole d’inhibition de la kinase Aurora-A (AS) en fin de prométaphase, après la mise en place du fuseau bipolaire, juste avant la transition prométaphase/métaphase. En inhibant la kinase Aurora-A (AS) à ce stade de la mitose, j’ai pu mettre en évidence un rôle original de la kinase Aurora-A dans la stabilité du fuseau bipolaire en lien avec le maintien du point de contrôle de la mitose SAC, actif. En effet, le SAC est un mécanisme de contrôle cellulaire qui est actif dès le début de la mitose, après la rupture de l’enveloppe nucléaire (NEBD) jusqu’en métaphase. Son rôle principal est d’arrêter la progression de la mitose en empêchant la transition métaphase/anaphase pour permettre aux cellules d’aligner correctement leurs chromosomes sur la plaque équatoriale (ou plaque métaphasique) afin de réaliser une ségrégation équitable des chromatides sœurs en anaphase.
Ensuite, je me suis intéressé à la caractérisation de ce rôle en recherchant les protéines du SAC qui seraient affectées par l’inhibition de l’activité kinase de Aurora- A. C’est ainsi que j’ai trouvé que la localisation des effecteurs terminaux du SAC (Mad2 et BubR1) était perturbée sous l’inhibition de la kinase Aurora-A. Les protéines Mad2 et BubR1 se localisent au niveau des kinétochores non attachés aux microtubules. Elles émettent un signal d’arrêt en inhibant la Cdc20 et empêchent ainsi l’activation de l’APC/C qui déclenche le passage en anaphase. Ces deux protéines ne sont pas des partenaires connus de la kinase Aurora-A.
Ces résultats originaux m’ont conduit en dernier ressort à chercher à identifier quel serait le partenaire de la kinase Aurora-A qui serait requis pour la localisation correcte de Mad2 et BubR1 aux kinétochores ? Pour tenter de répondre à cette question, j’ai utilisé l’approche candidat. Le laboratoire d’Ed Salmon (Howel et al., 2001) a montré que P150glued, la protéine motrice du complexe Dynéine/Dynactine était impliquée dans l’inactivation du SAC en délocalisant les protéines du SAC aux kinétochores en particulier Mad2. La Dynéine et la Dynactine sont des kinésines motrices du fuseau mitotique. Dans notre laboratoire, Romé et al. (2010) ont montré que P150glued est un substrat mitotique de la kinase Aurora-A. Ensuite, Reboutier et al. (2013) ont identifié le site phosphorylé de P150Glued humaine (sérine 19) par la kinase Aurora-A. Cette phosphorylation est requise pour la réalisation de l’anaphase B. Par conséquent, j’ai choisi de tester P150glued en utilisant un mutant (S19D) qui mime constitutivement sa phosphorylation et un mutant non phosphorylable (S19A) dans une expérience pour sauver le phénotype de Mad2 aux kinétochores. Cette expérience de sauvetage du phénotype n’a pas réussi, bien qu’elle ait montré que la phosphorylation du résidu S19 de P150glued est requise pour maintenir le SAC actif en prométaphase. Ceci suggère que le rôle de la kinase Aurora-A sur le maintien
d’un SAC actif passe par d’autres protéines en plus de P150glued qui restent à déterminer.