Obésité et infection par la bactérie Streptococcus pneumonia 88

1. Modèle d’infection de souris minces ou obèses par Streptococcus pneumonia

Figure 24. Protocole expérimental d’infection de souris minces et obèses par S. pneumoniae. Des souris mâles C57BL/6, âgées de 6 semaines au début de l’expérimentation, sont nourries pendant 8 à 10 semaines avec le régime Chow (contenant 3-4% de lipides) ou avec le régime obésogène High Fat (contenant 60% de lipides). L’infection par S. pneumoniae à une dose de 105 est alors réalisée par voie intra-nasale sur les souris anesthésiées. La mortalité et la perte de poids corporel sont suivies quotidiennement. Poumons, rate, cerveau et foie sont récupérés 72h post-infection (p.i.) pour évaluer la charge bactérienne (technique de numération des colony forming units (CFUs)), les dommages tissulaires (histologie), la composition en cellules immunes (cytométrie en flux (FACS)), les sécrétions des cytokines in situ (ELISA sur extraits protéiques), ainsi que l’expression des gènes codant les protéines de jonctions serrées et les cytokines pro- et anti-inflammatoires (RT-qPCR) (Figure 24).

2. Dénombrement des colonies bactériennes par la technique des CFUs

Les poumons, la rate, le foie et le cerveau sont prélevés 72 p.i. et placés dans 1 mL de PBS. Les tissus sont broyés à l’Ultra-Turrax et les solutions obtenues sont diluées de 10-1 à 10-5. Pour chaque dilution, 3 dépôts de 20 µL sont immédiatement réalisés sur une gélose contenant du sang de mouton (5%) puis laissés sécher. Les boites de Pétri ainsi ensemencées sont placées à 37°C pendant 24h. On procède alors au comptage des colonies bactériennes, qui présentent un aspect luisant et blanchâtre et sont entourées d’un halot d’hémolyse.

6-8 semaines J0 C57BL/6 JRj, Mâle-agées de 6 semaines 72h Sp1 10^5 Par voie intranasale

Suivi quotidien: mortalité et perte de poids

•!CFU •!Histologie •!Q-PCR •!ELISA •!FACS HFD (60% gras) Chow(3-4% gras) J10 !"#$"%&'''''''(")*'''''''''''+,-*''''''.*/0*,#'

3. Analyse quantificative de l’expression des gènes par RT-qPCR

Les poumons et les cerveaux sont récupérés 72h p.i. congelés immédiatement en azote liquide, puis conservés à -80°C. Les échantillons sont par la suite transférés dans des tubes de 5 mL contenant 1 mL de Trizol puis homogénéisés à l’Ultra-Turrax. L’homogénat obtenu est utilisé pour une extraction d’ARN. Brièvement, après avoir rajouté 200 µL de chloroforme, les échantillons sont centrifugés à 12.000 rpm pendant 15 minutes permettant d’obtenir 2 phases et une interphase. La phase aqueuse, qui contient l’ARN, est délicatement récupérée. On rajoute 500 µL d’éthanol 70%, puis on transfère les échantillons sur colonnes. Des lavages successifs sont effectués avec les tampons fournis avec le

kit d’extraction RW1 et RPE. L’élution se fait par la suite dans 30µL d’eau RNase free, et l’ARN obtenu est dosé avec le spectromètre (NanoView).

Nous procédons par la suite à une rétro-transcription de 10µg d’ARN en utilisant le kit High capacity

RNA to c-DNA (Applied Biosystem, Thermofisher). Une PCR Quantitative est effectuée pour évaluer

l’expression des gènes codant les protéines de jonction serrée et les marqueurs d’inflammation. Le programme d’amplification débute par une étape de dénaturation (3 minutes à 95°C) suivie de 40 cycles alternant dénaturation (10 secondes à 95°C), hybridation (60°C pendant 15 secondes) et élongation (72°C pendant 30 secondes). Chaque échantillon est passé en triplicat. Pour s’assurer de la spécificité des primers, nous nous sommes basé sur l’aspect de la courbe de dissociation en fin de cycle, qui devait présenter un seul pic.

L’évaluation quantitative relative a été effectuée par la méthode comparative ΔΔCt. La moyenne des ΔCt des échantillons contrôles non infectés pour chaque gène a été utilisé comme calibrateur suite à la normalisation par rapport au gène de ménage contrôle (Eef2). Les résultats sont présentés en fold-

change par rapport au gène de ménage et par rapport au contrôle (quantification relative = 2-ΔΔCt).

4. Quantification des protéines par ELISA

Pour obtenir des extraits protéiques, les organes ont été récupérés à sec dans de l’azote liquide puis conservés à -80°C. Les échantillons sont par la suite directement placés dans du tampon de lyse (Tissue Protein Extraction Reagent, Thermo Fisher Scientific 78510) additionné à un cocktail d’anti- protéases (Complete™, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail, Roche). Après homogénéisation avec l’Ultra-Turrax, les échantillons sont centrifugés à 12000 rpm/5min pour éliminer les fragments de tissu non lysés.

5. Dissection des différentes régions du cerveau

Les cerveaux fraichement récupérés ont été disséqués pour séparer les différentes parties (i.e. cortex cérébral, cortex cérébelleux, hypothalamus, bulbes olfactifs, hippocampe, striatum) permettant ainsi

! PK!

une étude plus élaborée et plus spécifique de l’effet de l’infection et l’obésité sur le système nerveux central. Nous avons procédé à la récupération des différentes parties du cerveau comme le montre le schéma qui suit (Figure 25).

Figure 25. Localisation des différentes parties du cerveau étudiées.

(A) Vue d’ensemble du cerveau, (B) Coupe sagittale du cerveau de souris et localisation des différentes régions récupérées : hippocampe, cortex cérébelleux, cortex cérébral, hypothalamus, striatum, bulbe olfactif, et hippocampe.

6. Préparation des organes pour la cytométrie en flux Traitement des poumons

Les souris sacrifiées sont perfusées avec du PBS froid jusqu’à ce que le foie soit bien blanc. Les poumons sont par la suite récupérés dans du PBS + SVF (2%) et maintenus sur glace jusqu’au traitement. Brièvement, les poumons sont coupés très finement puis incubés pendant 20 minutes à 37°C dans un cocktail composé de : milieu RPMI + Collagénase VIII + DNase. Après arrêt de la réaction (par addition de V/V de PBS + SVF (2%)) , la séparation des cellules s’effectue par passages multiples des échantillons à travers une aiguille G22 suivis d’une filtration à travers un filtre cellulaire. Les échantillons sont alors centrifugés pendant 5 minutes à 1400 rpm. Le culot est resuspendu dans une solution de Percoll à 20% puis centrifugés à 1400 rpm pendant 15 minutes pour ne garder en culot que les cellules immunes. La lyse des globules rouges est effectuée après incubation des échantillons pendant 5 minutes à température ambiante dans un tampon de lyse, suivie d’une centrifugation à 1400 rpm/ 5 minutes. Le culot est resuspendu dans 1 mL de PBS 2% SVF, et les cellules sont comptées après coloration avec du bleu de Trypan pour identifier les cellules mortes.

Traitement des cerveaux

Les cerveaux sont récupérés, après perfusion totale de la souris (sacrifiée au Pentobarbital), avec du PBS 2% SVF froid. Les échantillons sont par la suite homogénéisés à l’aide d’un Potter de 7 mL dans

une solution de Percoll 30%. Cet homogénat est délicatement déposé sur une solution de Percoll 70% de façon à obtenir deux phases. Une centrifugation à 500g pendant 30 minutes sans frein, permet d’obtenir une interphase qui contient la fraction de cellules immunes. Les cellules sont délicatement récupérées à l’aide d’une pipette de transfert, diluées dans PBS 2% SVF, filtrées avec un filtre cellulaire et centrifugée à 500g pendant 5 minutes. Une lyse des globules rouges est par la suite effectuée comme mentionné précédemment. Les cellules sont comptées après coloration au Bleu de Trypan.

7. Histologie des poumons

Les poumons des souris sacrifiées et perfusées avec du PFA sont délicatement récupérés et fixés dans du Paraformaldéhyde (PFA) 4% pendant 2 jours. Les poumons sont alors transférés dans de l’éthanol 70%. Une fois inclus en paraffine, les échantillons sont coupés à une épaisseur de 5 µm puis colorés à l’hématoxyline-éosine (H&E).