Les vitamines sont généralement présentes en quantités suffisantes dans les moûts de raisin pour un bon déroulement de la fermentation alcoolique, mais leur addition est bénéfique pour la croissance cellulaire et peut jouer un rôle dans la production des composés d’arôme (Hagen et al., 2008; Bohlscheid et al., 2007; Edwards and Bohlscheid, 2007; Wang et al., 2003) (Figure 17).
La biotine peut potentiellement impacter la production de nombreux arômes tels que les alcools supérieurs, les esters et les acides gras à moyenne chaîne (Lynen et al., 1980). Une carence en biotine peut entraîner une synthèse insuffisante d’α-cétoglutarate et par la suite une production réduite d’acides aminés, influençant la production des alcools supérieurs notamment (Bohlscheid et al., 2007) (Figure 17).
Des carences en biotine et en acide pantothénique peuvent conduire à des concentrations réduites en acides gras à moyenne chaîne et leurs esters dans le vin. La biotine est nécessaire à l’activation de l’acétyl-CoA carboxylase durant la biosynthèse de novo des acides gras (Forch et al. 1975). L’acide pantothénique a quant à lui un rôle de composant structurel du coenzyme A. Une telle carence entraîne donc une diminution des concentrations en acétyl-CoA. Dans les deux cas, ceci conduit à une réduction de la synthèse des acides gras, et donc à des concentrations plus faibles en acides gras à chaîne moyenne et en esters correspondants (Bohlscheid et al., 2007; Edwards and Bohlscheid, 2007; Wang et al., 2003).
La thiamine intervient sous forme de thiamine pyrophosphate (TPP) dans différentes voies métaboliques (Figure 17) : au niveau de la VPP pour la formation des acides aminés aromatiques, au niveau de la voie d’Ehrlich pour la formation des composés d’arôme (esters et alcools supérieurs) et au niveau de la réaction principale pour la formation d’éthanol (Li et al. 2010).
Introduction bibliographique
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Les minéraux et les ions métalliques sont des micronutriments essentiels qui jouent des rôles physiologiques importants durant la croissance cellulaire et la fermentation alcoolique (Pereira, 1988), mais ces facteurs nutritionnels sont souvent négligés par rapport à leur contribution à l’arôme des vins (Ibanez et al., 2008). Par exemple, le zinc sert de co-facteur à un grand nombre de réactions enzymatiques. De Nicola et al. (2009) ont montré que des additions de zinc au cours de la fermentation du malt par S. cerevisiae augmentent les concentrations d'esters et d'alcools supérieurs (en particulier ceux en provenance des acides aminés à chaîne ramifiée) et réduisent la formation d'acétaldéhyde.
Figure 17. Voies métaboliques dans lesquelles interviennent la thiamine et la biotine (d’après Li et al.
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Matériels et
Matériels et méthodes
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1 Souches de levure
Les souches de levure Saccharomyces cerevisiae Lalvin EC1118® et Affinity™ ECA5 ont été utilisées pour l’ensemble des fermentations réalisées au cours de ce travail. Cinq autres souches (Lalvin ICV K1M®, Lalvin ICV D47®, Lalvin Rhône 2226®, Lalvin FC9 EDV® et UCD522) ont été utilisées lors de l’étude de l’effet du fond génétique. L’ensemble de ces souches est produit sous forme de levure sèche active (LSA) par la société Lallemand SA (Montreal, Canada). Chaque fermenteur est inoculé avec 10 g/hL de LSA préalablement réhydratés dans une solution à 50 g/L de glucose pendant 30 min à 37°C (1 g de LSA pour 10 mL de solution).
2 Milieux synthétiques
Le milieu synthétique (MS) utilisé présente les caractéristiques moyennes d’un moût de raisin (Bely et al., 1990a). Ce milieu est caractérisé par une forte concentration en sucres (glucose et fructose en proportions identiques), une teneur limitante en azote et un pH acide (pH= 3.3). On considère comme azote assimilable l’azote ammoniacal et l’azote des acides aminés à deux exceptions près : l’atome d’azote de la proline qui n’est pas assimilable en anaérobiose et un des quatre atomes de l’arginine. La composition du MS est présentée dans les tableaux 5 à 10. Les moûts synthétiques sont stockés à -20°C.
Plusieurs concentrations initiales en azote assimilable sont utilisées pour cette étude, de 70 à 425 mgN/L. L’exemple présenté dans le tableau 5 est celui qui mime un milieu avec une teneur en azote assimilable de 425 mgN/L.
Plusieurs concentrations initiales en facteurs anaérobies (phytostérols) sont utilisées au cours de cette étude, de 2 à 8 mg/L.
Pour les expériences de marquage isotopique, nous avons utilisé une source d’azote marquée en 13C (Eurisotop®, France). La liste des composés azotés marqués utilisés dans cette étude est détaillée dans le tableau 11.
66 Tableau 5. Composition du milieu synthétique utilisé pour les fermentations. Exemple du milieu avec
425 mgN/L d’azote assimilable et 5 mg/L de facteurs anaérobies.
Tableau 6. Composition de la solution mère d’oligo-éléments
Tableau 7. Composition de la solution mère de vitamines
Composés Quantité par litre
Glucose 100 g Fructose 100 g Acide malique 6 g Acide citrique 6 g Phosphate de potassium 0,75 g Sulfate de potassium 0,5 g Sulfate de magnésium 0,25 g Chlorure de calcium 0,155 g Chlorure de sodium 0,2 g Chlorure d'ammonium 0,46 g
Solution mère d'oligo-éléments 1 mL
Solution mère de vitamines 10 mL
Solution mère de facteurs anaérobies 0,33 mL
Solution mère d'acides aminés 13,06 mL
Solution mère de chlorure de fer 1 mL
Le pH du milieu est ajusté à 3,3 avec une solution de NaOH 10M
Composés Quantité par litre
Sulfate de manganèse monohydraté 4 g
Sulfate de zinc heptahydraté 4 g
Sulfate de cuivre pentahydraté 1 g
Iodure de potassium 1 g
Chlorure de cobalt hexahydraté 0,4 g
Acide borique 1 g
Ammonium heptamolybdate 1 g
La solution mère d'oligo-éléments est stérilée par filtration 0,22µm et conservée à 4°C
Composés Quantité par litre
Myo-inositol 2 g Pantothénate de calcium 0,15 g Thiamine, hydrochloride 0,025 g Acide nicotinique 0,2 g Pyridoxine 0,025 g Biotine 3 mL
Matériels et méthodes
67 Tableau 8. Composition de la solution mère de facteurs anaérobies
Tableau 9. Composition de la solution mère de chlorure de fer
Tableau 10. Composition de la solution mère d’acides aminés
Tableau 11. Liste des composés marqués en 13C obtenus chez Eurisotop®
Composés Quantité par litre
Phytostérols 1,5 mg
Tween 80 50 mL
Ethanol pur qsl 100 mL
La solution mère de facteurs anaérobies est conservée à 4°C
Composés Quantité par litre
Chlorure de fer (III) hexahydraté 20 g
La solution mère de chlorure de fer est conservée à 4°C
Composés Quantité par litre
Acide aspartique 3,4 g Acide glutamique 9,4 g Alanine 11,1 g Arginine 28,6 g Cystéine 1 g Glutamine 38,6 g Glycine 1,4 g Histidine 2,5 g Isoleucine 2,5 g Leucine 3,7 g Lysine 1,3 g Méthionine 2,4 g Phénylalanine 2,9 g Proline 46,8 g Sérine 6 g Thréonine 5,8 g Tryptophane 13,7 g Tyrosine 1,4 g Valine 3,4 g
La solution mère d'acides aminés est conservée à -20°C
Composés Marquage Références
L-valine 13C5, 97-98% CLM-2249 L-leucine 13C6, 97-99% CLM-2261
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3 Mise en œuvre des fermentations et suivi de la cinétique
fermentaire
Les fermentations sont réalisées dans des fermenteurs à trois échelles différentes : 300 mL, 1,2 L et 10 L de volume utile. Le milieu initial est systématiquement inerté à l’argon pour obtenir l’anaérobiose. Le temps d’inertage varie en fonction de l’échelle : 20 minutes pour les fermenteurs de 300 mL, 40 minutes pour ceux de 1,2 L et 1 heure pour ceux de 10 L.
Le taux de remplissage est « normalisé » pour les différentes échelles. Ainsi, les fermenteurs de 300 mL contiennent 280 mL de milieu liquide ; ceux de 1,2 L contiennent 1,1 L ; enfin les fermenteurs de 10 L sont remplis avec 9 L de milieu.