Numération manuelle

Il permet de noter:

- l'aspect des urines: limpide, trouble

- la couleur : jaune, hématique, éventuellement colorée par les médicaments [7].

b- Examen microscopique

Elle s'effectue directement sur un échantillon d'urine au microscope en utilisant un hématimètre. La numération des éléments figurés des urines se fait dans un hématimètre en verre de type Nageotte, Lemaur, ou Malassez dans des volumes respectifs de 50, 40, et 1 mm³. La cellule Kova est aussi utilisée. Le résultat est exprimé par mm³, ou par ml.

Les urines normales contiennent moins de 10 leucocytes par mm³ soit 10⁴/ml et moins de 10 hématies par mm³ soit aussi 10⁴/ml [16, 18].

Le seuil de leucocyturie retenu comme pathologique est fixé à une valeur

≥ 10⁴ /ml [1, 8, 18].

Néanmoins, une leucocyturie peut être absente dans d’authentiques infections urinaires :

- si l’ECBU a été effectué trop tôt ;

- chez certains patients ayant une neutropénie ; - si les urines ne sont pas traitées rapidement.

Ensuite, la numération semi-quantitative de cylindres, cellules épithéliales, cristaux, de levure est systématiquement effectuée.

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 Coloration GRAM

La coloration Gram d’un frottis urinaire permet d’avoir des informations sur la morphologie des bactéries et le type de Gram [19].

 Uroculture

C’est la culture des microorganismes à partir des urines prélevées de façon aseptique. Elle permet de faire la numération bactérienne et modes d’ensemencement permettant l’évaluation quantitative de la bactériurie à savoir : la méthode originale de Kass, la méthode simplifiée de Véron, la méthode de la lame immergée et la méthode de l'anse calibrée.

Cette dernière est actuellement la plus utilisée. Pour ce fait, l'urine est prélevée à l'aide d'une anse de 10μl et ensemencée selon une méthode standardisée qui permet de convertir l'aspect de la culture en UFC/ml, et ce sans dénombrement. Cette méthode simple, sans dilution préalable, permet une numération de 10³ à 10⁶UFC/ml tout en permettant l'obtention de colonies isolées.

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I.2.3.-Numération automatisée

Il existe plusieurs automates qui peuvent être utilisés dans l’analyse cytobactériologique des urines. Nous avons entre autres : l’Urised, le SediMAX, l’UF-500i et l’UF-1000i. Chacun d’eux est basé sur un principe [1, 10, 21].

 UF-500i et UF-1000i

Leur principe de fonctionnement repose sur la fluoro-cytométrie en flux. Basés sur la technologie de lasers semi-conducteurs et l’utilisation de polymethines comme fluorochromes, ils permettent d’effectuer une numération des hématies, des leucocytes, des bactéries, des cylindres et des cellules épithéliales. S’y ajoutent une mesure quantitative pour les cristaux, les levures, les spermatozoïdes, les cylindres pathologiques, les petites cellules rondes ainsi que la détection du mucus. Les urines sont automatiquement homogénéisées et traitées à une cadence d’environ 100 échantillons par heure. Le volume minimal nécessaire est d’environ 1 ml. Les éléments urinaires, marqués avec les fluorochromes, sont hydro-dynamiquement focalisés dans un flux de gainage. Ils traversent le faisceau laser. La lumière laser diffusée, la fluorescence et l’impédance sont détectées séparément et sont transformées en signaux électriques. Chaque particule est différenciée selon 3 paramètres : taille, structure et la fluorescence.

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DEUXIEME PARTIE :

MATERIEL ET METHODES

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2.1. Cadre

La présente étude a été rendue possible grâce à deux cadres : l’un institutionnelle et l’autre technique.

L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi, a servi de cadre institutionnel. Particulièrement, le département de Génie de Biologie Humaine qui a assuré notre formation pendant trois ans.

Le Centre National Hospitalier Universitaire Hubert Koutoukou MAGA de Cotonou a servi de cadre technique. Il a été créé en 1962 par la loi N°62-36 du 30 octobre 1962 et est l’hôpital de dernier recours au Bénin.

Le CNHU-HKM est organisé en plusieurs services, parmi lesquels nous avons les services médicotechniques tels que la radiologie et les laboratoires de : l’hématologie, l’immuno-hématologie, la biochimie clinique et la microbiologie divisée en deux services : le service de Parasitologie-Mycologie-Sérologie et celui Bactériologie-Virologie.

Le service de Bactériologie-Virologie, où se sont déroulés les travaux de cette étude, est logé dans le bloc multisectoriel des laboratoires et fait face au laboratoire de Biochimie clinique. Divers examens sont réalisés dans ce service à savoir : l’examen cytobactériologique des urines; le spermogramme, le spermocytogramme; la spermoculture ; la coproculture ; l’hémoculture ; et la recherche de bacilles acido-alcoolo-résistants.

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2.2. Matériel

2.2.1. Type d’étude

Il s’agit d‘une étude prospective transversale qui s’est déroulée du 06 Juin au 06 Septembre 2014.

2.2.2. Matériel biologique

Il est composé de 350 échantillons d’urines de patients reçus au CNHU-HKM de Cotonou.

 Collecte des données

La collecte des données a été faite à partir de la fiche d’enquête (Annexe I).

2.2.3. Milieux de culture

La gélose CLED a été utilisée pour la numération des microorganismes.

2.2.4. Réactifs

Cinq types de réactif et un type d'échantillon de contrôle ont été utilisés dans cette étude. Il s’est agi de :

Tous sont des réactifs spécifiques du Sysmex UF- 500i (Annexe II).

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2.3. Méthodes

2.3.1. Premier jour

 Phase pré-analytique

Les échantillons d’urines ont été réceptionnés en tenant compte des critères d’exclusion. Les échantillons présentant une hématurie macroscopique, à forte concentration de petites particules de mucus ou de débris, acheminés plus de 2 heures dans le laboratoire ou insuffisants n’ont pas été pris en compte. Ils sont ensuite étiquetés et enregistrés.

Les lames ainsi que les cellules de Malassez ont été identifiées.

 Phase analytique - Méthode manuelle

 Macroscopie :

L’échantillon a été homogénéisé. La couleur et la turbidité des urines ont été appréciées. calibrée de 10µl. Ensuite, il a été réparti dans l’une des chambres de la cellule de Malassez par capillarité. Un temps de sédimentation d’environ 3min a été observé.

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 Lecture

La lecture a été faite au microscope optique à l’objectif x40. La numération des leucocytes et des hématies a été faite dans les 10 bandes de la cellule. Cela a permis d’avoir la leucocyturie et l’hématurie par mm ³. Sachant que 1mm³ correspond 10^-3ml, une conversion a été effectuée afin d’obtenir les valeurs par ml.

- Méthode automatisée

Pour cette étude, le Sysmex UF-500i a été utilisée.

 Technique

Il existe deux types d'analyses des échantillons : le mode manuel et le mode passeur. Au cours de l’étude, le mode manuel a été utilisé.

L'analyse en mode manuel a été effectuée quand l'appareil est prêt pour l'aspiration. Pour cela l'échantillon d’urines a été homogénéisé et un résultats ont été reportés sur la fiche d’enquête.

 Phase post-analytique

A la fin de la manipulation, les cellules de Malassez ont été rincées, les pots d’urine ont été détruits, la paillasse a été nettoyé, le nettoyage et la maintenance de l’appareil ont été effectués (Annexe IV).

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2.3.2. Deuxième jour

Les résultats ont été transcris directement sur la fiche d’enquête.

2.3.3. Analyse des données

La saisie et l’analyse des données ont été faites avec les logiciels Epi data, Microsoft Excel et XL Stat version 2011.

Les paramètres étaient la leucocyturie, l’hématurie et la bactériurie. Les moyennes de ces différents paramètres ont été comparées deux à deux à l’aide du test de Student à un seuil de significativité de 5%.

2.3.4. Contrôle de qualité

Le contrôle de qualité de cette étude s’est limité à la sensibilité et la spécificité.

Dans le contexte du laboratoire d’analyses biomédicales, la sensibilité et la spécificité d’un test de diagnostic sont habituellement déterminées respectivement comme la probabilité que ce test soit positif quand le patient est malade et la probabilité que le test soit négatif quand le patient n’est pas malade. En l’absence des données cliniques, le recours à une méthode de référence est préconisé, à condition que la sensibilité et la spécificité de cette méthode soient supérieures à 95%

[22].

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Dans cette étude, la méthode de référence est la méthode manuelle.

Les formules suivantes ont été utilisées : VN

V_N : le paramètre compté est non significatif par deux méthodes.

F_N : le paramètre compté est significatif par la méthode manuelle et non significatif par la méthode automatisée.

VP : le paramètre compté est significatif par les deux méthodes.

F_P : le paramètre compté est non significatif par la méthode manuelle et, significatif par la méthode automatisée.

L’algorithme suivant résume la méthodologie suivie : V_N+F_P

Spécificité =

VP+FN

Sensibilité =

V_P

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TROISIEME PARTIE :

RESULTATS ET COMMENTAIRE

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3.1. Moyennes et écart-types des différents paramètres évalués.

Le Tableau I indique la comparaison des moyennes et écart-types des paramètres évalués.

Tableau I : Comparaison des moyennes et écart-types des paramètres évalués.

Les moyennes portant les mêmes lettres ne sont pas significatives au seuil de significativité de 5%.

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3.2. Caractéristiques des patients

3.2.1. Répartition des patients en fonction du sexe

La Figure I montre que 54% des échantillons d’urines provenaient des femmes.

Figure I: Répartition des patients en fonction du sexe Féminin

54%

Masculin 46%

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3.2.2. Répartition des patients en fonction de l’âge

La Figure II montre la répartition de la population en fonction de l’âge.

La tranche d’âges la plus représentée était celle de 20 à 30 ans soit un taux de 22,86%.

Figure II : Répartition des patients en fonction de l’âge.

13,14%

[0-10] [10-20] [20-30] [30-40] [40-50] [50-60] [60-70] [70-80] [80-90]

Fréqences (%)

Tranches d'âges

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3.3. Caractéristiques biologiques des échantillons

3.3.1. Répartition des échantillons en fonction de la leucocyturie et de la bactériurie pour chaque méthode

Le Tableau II indique qu’une bactériurie significative a été observée pour 44,83% (39/87) d’échantillons d’urines à leucocyturie significative.

Tableau II : Répartition des échantillons en fonction de la leucocyturie et de la bactériurie pour la méthode automatisée.

Leucocyturie (/ml)

Bactériurie (/ml) Total

<30000 ≥ 30000

n=263 (%) n=87 (%) n=350(%) <10⁴ 262 48 310 (99,62) (55,17) (88,57) ≥ 10⁴ 01 39 40 (00,38) (44,83) (11,43)

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Le Tableau III montre qu’une bactériurie significative a été observée pour 42,75% (56/131) d’échantillons d’urines à leucocyturie significative.

Tableau III: Répartition des échantillons en fonction de la leucocyturie et de la bactériurie pour la méthode manuelle.

Leucocyturie (/ml)

Bactériurie (/ml) Total <10⁴ ≥ 10⁴

n=219 (%) n=131(%) n=350(%) <10⁴ 150 75 225 (68,49) (57,25) (64,29)

≥ 10⁴ 69 56 125 (31,51) (42,75) (35,71)

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3.3.2. Comparaison des deux méthodes

Le Tableau IV montre la comparaison des résultats de la leucocyturie entre les deux méthodes. Sur les 350 échantillons d’urines étudiés, 04 présentent des résultats discordants soit 1,14 %.

Tableau IV : Comparaison des résultats de la leucocyturie entre les deux méthodes.

Méthode manuelle

Méthode automatisée Total Significative Non significative

≥ 10⁴(%) <10⁴(%)

Significative 86 00 86 (96) (00)

≥ 30000

Non significative 04 260 264 (04) (100)

<30000

Total 90 260 350 (100) (100)

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Le Tableau V montre que sur les 350 échantillons d’urines étudiés, 20 présentent des résultats discordants en ce qui concerne l’hématurie soit 05, 71%.

Tableau V : Comparaison des résultats de l’hématurie entre les deux méthodes.

Méthode manuelle

Méthode automatisée Total Significative Non significative

≥ 10⁴(%) <10⁴(%)

Significative 40 20 60 ≥ 30000 (100) (06,45)

Non significative 00 290 290

<30000 (00) (93,55)

Total 40 310 350 (100) (100)

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Le Tableau VI montre que sur les 350 échantillons d’urines étudiés, 85 présentent des résultats discordants pour la bactériurie soit 24,29%.

Tableau VI : Comparaison des résultats de la bactériurie entre les deux méthodes.

Méthode manuelle

Méthode automatisée Total Significative Non significative

≥ 10⁴(%) <10⁴(%)

Significative 40 00 40 ≥ 10⁴ (32) (00)

Non significative 85 225 310 <104

(68) (100)

Total 125 225 350 (100) (100)

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Le tableau VII montre la performance de l’automate dans la détection des paramètres évalués. La sensibilité et la spécificité de l’UF-500i sont respectivement pour la leucocyturie 95,56% et 100%, pour l’hématurie100% et 93,55% et pour la bactériurie 32% et 100%.

Tableau VII : Performances de l’automate dans la détection des paramètres évalués

Paramètres Sensibilité

(%)

Spécificité (%)

Leucocytes 95,56 100

Hématies 100 93,55

Bactéries 32 100

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3.4. Commentaire

L’objectif général de cette étude était de comparer les résultats de la méthode manuelle à ceux du Sysmex UF- 500i dans l’examen cytobactériologique des urines. Un mois après son installation, nous avons mené une étude prospective sur 350 échantillons d’urines provenant de patients hospitalisés et externes.

Sur les 350 échantillons d’urines examinés, 54% provenaient des femmes. Cette fréquence élevée de femmes à infection urinaire potentielle s’explique par l’anatomie féminine, plus enclin aux infections urinaires que l’appareil masculin. Cette assertion est en adéquation avec les travaux de Comes [1]. En effet, les résultats de ses travaux ont révélé que plus de la moitié de la population d’étude était de sexe féminin.

La tranche d’âges la plus représentée était celle de 20 à 30 ans (22,86%). C’est dans cette tranche d’âges en effet que s’observe une intense activité sexuelle. Cette observation est en concordance avec les résultats des travaux de Kouwafin & da-Matha [23]. Ces derniers ont noté une fréquence plus élevée dans cette tranche d’âges.

Une discordance de 05,71% a été observée pour la numération des hématies. En effet, les hématies détectées par l’automate s’avèrent souvent être des levures ou des cristaux. Cette observation confirme les travaux réalisés par Geudet et al. [24] puis Murotani et Nishi-ku [25]. Ces derniers ont montré que l’automate détecte des levures, des cristaux et même les bulles d’air comme étant des globules rouges.

Pour pallier une telle situation, il faudrait que le technicien réalise un contrôle microscopique de la répartition des éléments ou un décompte total avec une cellule de numération.

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Pour la bactériurie, il y a eu une discordance de 24,29% des résultats pour les deux méthodes. La poursuite du diagnostic d’une infection urinaire repose sur une bactériurie et une leucocyturie significatives [13]. Dans cette étude, avec la méthode automatisée, 74,05% des échantillons sont à leucocyturie et à bactériurie non significative. Cela est en concordance avec les travaux de Wang et al.

en 2013 [26] qui ont montré que dans la plupart des cas, la majorité des échantillons sont à culture négative. Cependant, au laboratoire du CNHU-HKM avec la méthode manuelle tous les échantillons sont systématiquement ensemencés sur plusieurs milieux. Ainsi, l’automate réduit considérablement le temps de rendu des résultats dont la culture s’avère négative de 24 heures à quelques minutes.

La sensibilité de l’UF-500i pour les leucocytes et des hématies est respectivement de 95,56%, 100% et 32%. Quant à sa spécificité, elle est de 100% pour les leucocytes, 93,55% pour les hématies et 100% pour les bactéries. Il en ressort que l’UF-500i est performant dans la numération des hématies et des leucocytes. Ceci est en adéquation avec les recommandations de la norme NFISO 3534. En effet, elle recommande que les performances analytiques d’une technique sont bonnes lorsque la sensibilité et la spécificité de cette technique sont supérieures à 80%.

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CONCLUSION ET

SUGGESTIONS

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CONCLUSION

Cette étude nous a permis de réaliser une évaluation comparative de la méthode manuelle et du Sysmex UF-500i dans la réalisation de l’examen cytobactériologique des urines. A l’issue des travaux réalisés, nous pouvons dire que l’automate est performant dans la numération des hématies et leucocytes. Aussi, permet-il un gain de temps technique non négligeable et un dépistage rapide des échantillons d’urines à culture négative.

Toutefois, il présente une insuffisance d’ordre technique en ce qui concerne les échantillons d’urines à leucocyturie et bactériurie significatives. En effet, il ne fait pas l’identification bactérienne et est obligé d’être suppléé par la méthode manuelle dans ces cas. Loin d’être un substitut à la méthode manuelle, il vient plutôt la compléter.

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SUGGESTIONS

A la lumière de nos résultats, nous formulons les suggestions suivantes:

 A l’endroit du ministère de la santé:

- De veiller à équiper les laboratoires de biologie médicale, d’appareils de qualité et d’un environnement propice à une bonne conservation de ces appareils.

 A l’endroit des autorités du service de Bactériologie-virologie du CNHU-HKM de Cotonou:

- Mettre à la disposition des biotechnologistes des microscopes de qualité ainsi que des consommables.

- Renforcer le personnel du laboratoire.

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REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES

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