Le niveau d’expression d’Arl2 influence la progression mitotique et

La dynamique microtubulaire est un élément essentiel au bon déroulement de la mitose. Nous avons donc étudié la distribution en cycle cellulaire des cellules MA-, MP et MA+ en phase exponentielle de croissance par cytométrie de flux (figure 23a). Les cellules MA- présentaient un pourcentage significativement (p<0,05) plus faible de cellules en phase G2/M (7.8%) comparées aux cellules MP (12%) alors que les cellules MA+ présentaient une fraction de cellules en G2/M plus élevée (15.8%). Comme nous n’avons relevé aucune différence dans la vitesse de prolifération des 3 lignées cellulaires (figure 23b), ces résultats suggèrent que les cellules MA- pourraient subir une transition G2 à M plus rapide et passer moins de temps en phase G2 que les cellules MP. A l’inverse, les cellules MA+ pourraient avoir une transition G2/M ralentie par rapport aux autres cellules.

Les indices mitotiques, ana-télophasiques et cytokinétiques ont été évalués en utilisant l’analyse microscopique. Nous avons observé des pourcentages de cellules mitotiques et ana-télophasiques significativement (p<0.05) plus élevés pour les cellules MA+ (4.2% et 1%) que pour les cellules MP (2.4% et 0.1%). Les cellules MA- présentaient des indices mitotiques et ana-télophasiques similaires à ceux des cellules MP (figure 23c).

Figure 23 : Distribution en cycle cellulaire, indices mitotiques et ana-/telophasiques vitesses de prolifération des cellules MA-, MP et MA+. a : distributions en phases G0/G1, S et G2/M déterminées par cytométrie de flux (gauche : graphes représentatifs, droite : moyennes des pourcentages des cellules en phase G2/M). b :moyennes des vitesses de proliferation évaluées par le test MTT et exprimée en unité de densité optique (DO) par heure. c : indices mitotiques et ana-/telophasiques évalués en microscopie confocale pour 600 cellules sur au moins 3 images différentes (gauche : images représentatives, droite : moyennes des pourcentages des cellules mitotiques et ana-/telophasiques). Les barres d’échelle correspondent à 20 µm, les flèches noires marquent les cellules ana-/télophasiques et les flèches grises les cellules pro-/métaphasique. Les barres d’erreur représentent les déviations standards. Les données sont représentatives d’au moins 3 expériences indépendantes et la signification statistique a été déterminée par le t-test de Student (+ : p <0.05 entre la lignée cellulaire d’intérêt et les autres lignées).

Pour quantifier l’indice cytokinétique de nos cellules, nous avons utilisé un double marquage α-tubuline-FITC et DAPI afin de mettre en évidence la formation de ponts cytoplasmiques intercellulaires fins enrichis en microtubules (microtubules du corps intermédiaire et du faisceau du sillon) avec présence d’un anneau central contractile d’actomyosine non marqué à l’α-tubuline, structures spécifiques de la cytokinèse (figure 24). Nous avons trouvé un pourcentage de cellules cytokinétiques significativement plus élevé (p<0.05, 12%) dans les cellules MA+ par rapport aux lignées MP et MA-. Il est à noter que les cellules cytokinétiques ne sont probablement pas comptabilisées dans la phase G2/M en cytométrie de flux car le pont cytoplasmique reliant les 2 cellules filles en cytokinèse est assez fragile et la cytométrie en flux nécessite un traitement relativement agressif pour mettre en solution des cellules adhérentes.

Figure 24 : Indices cytokinétiques (IC) des cellules MA-, MP et MA+. a : images représentatives de chaque lignée cellulaire après marquage de l’ADN au DAPI (bleu), de la α-tubuline (αtub, vert). Les moyennes des indices cytokinétiques (IC) sont évaluées par microscopie confocale pour 600 cellules sur au moins 3 images différentes. Les barres d’échelle correspondent à 10 µm, les flèches blanches marquent les cellules cytokinétiques et les flèches grises les cellules mitotiques. b : agrandissement de cellules MA+ cytokinétiques. La flèche bleu clair marque le faisceau de microtubules du sillon, la flèche jaune les microtubules du corps intermédiaire et la flèche rouge l’anneau contractile d’actomyosine (absence de marquage au milieu des microtubules du corps intermédiaire). Les barres d’échelle correspondent à 5 µm.

Afin d’évaluer le temps passé en chaque phase de mitose de nos cellules, nous avons procédé en l’observation microscopique longue (15h) en temps réel des cellules vivantes (figure 25a). Seules les mitoses complètes observées pendant le temps de l’observation ont été analysées. Aucune différence significative de la durée totale des mitoses n’a été observée entre les 3 lignées cellulaires MP, MA-, MA+ (figure 25b). Néanmoins, nous avons observé la présence de mitoses avortées ou bloquées en télophase/cytokinèse pour les cellules MA+ mais pas pour les cellules MP ni MA- (données non représentées). Ces cellules n’ont pas été comptabilisées pour l’évaluation des durées des différentes phases mais sont probablement comptabilisées dans le pourcentage de la phase G2/M des cellules MA+. De plus, nous avons observé une diminution significative (p<0.05, -40 min) du temps passé en pro- et métaphase pour les cellules MA+ par rapport aux cellules MP et MA- (figure 25c). Nous avons également observé une augmentation significative (p<0.05, +50 min) des durées des ana- et télophases des cellules MA+ par rapport aux cellules MP et une diminution significative (p<0.05, -15 min) des durées de ces phases dans les cellules MA- par rapport aux 2 autres lignées. Des différences identiques ont été observées dans les cellules transfectées MDA-MB-231. Les cellules MDAA+ présentaient une diminution significative de la durée des pro- et métaphases et une durée de télophase significativement augmentée par rapport aux cellules MDAP (données non représentées).

Ces données montrent que le contenu en Arl2 est corrélé à des altérations significatives de la progression mitotique. Un niveau d’Arl2 élevé est associé avec une diminution de la durée des pro- et métaphases, avec des télophases prolongées et des mitoses avortées alors qu’au niveau bas d’Arl2 est associé avec une télophase plus rapide.

Figure 25 : Progression mitotique des cellules vivantes MA-, MP et MA+. a : images représentatives et durées correspondantes de la progression mitotique ; première colonne : début de la prophase, deuxième colonne : début de l’anaphase, troisième colonne : début de la télophase et cytokinèse, quatrième colonne : fin de la mitose (re-adhesion cellulaire). b : moyennes des durées totales des mitoses en minutes. c : moyennes des durées des pro- et metaphase (gauche) et des télophases (droites) en minutes. Les barres d’erreur représentent les déviations standards. Les données sont représentatives d’au moins 3 expériences indépendantes et la signification statistique a été déterminée par le t-test de Student (+ : p <0.05 entre la lignée cellulaire d’intérêt et les autres lignées).