V0 = échelle de vitesse de
13. Nettoyage et stockage des capteurs : les capteurs et les puces PDMS sont nettoyés au
détergent, puis à l’eau distillée, et enfin placés sous rayonnement U.V. durant quinze
minutes pour décontamination avant d'être rangés dans leurs boîtes métalliques opaques à la lumière.
Ce nouveau protocole permet un contrôle et une détection simultanés. Les courbes typiques de réponse en fréquence ainsi obtenues lors des phases successives des détections indirectes en statique avec les puces PHS2, et plus spécifiquement la réponse à la détection du complexe bactérien en indirect, sont respectivement représentées sur la Figure 4-8 et la Figure 4-9.
Figure 4-8 Réponse typique complète en temps réel des trois phases successives nécessaires à la détection des bactéries E. coli avec le protocole statique (puce PDMS PHS2)
Figure 4-9 Réponse typique en temps réel lors de l’immobilisation des bactéries E. coli avec
le protocole statique (puce PDMS PHS2)
Notons que cette réponse est obtenue pour une densité optique initiale D.O=0,6, soit une concentration C0 d'environ 107E. coli/mL en solution initiale, ou encore une concentration
équivalente sur le capteur de C0 /4 (après dilution par 2 pour incubation avec les anticorps ACM4 et par 2 lors de l'ajout à la ligne de base pour la détection). Cette figure montre le bon fonctionnement global de ces cellules, avec des résultats en termes de sensibilité et de temps de réponse, similaires à ceux obtenus avec la cellule métallique initiale, comme c'était le cas pour les anticorps.
En conséquent, l’intérêt de cette configuration est d'utiliser un plus petit volume de liquide
déposé sur le capteur, avec contrôle et détection simultanées sur un même substrat. Le seuil de détection reste limité par la nature du contrôle (anticorps anti-E. coli seuls).
4.3.3. Nouvelle stratégie : utilisation de PEG (polyéthylène glycol)
pour la détection directe et indirecte en régime statique
Avec l’utilisation des puces PHS2 en statique, le temps nécessaire à la détection des
Application à la détection biologique 158
sur l’hypothèse d’une « densification » des bactéries sur la surface sensible du capteur augmentant l’effet surfacique, n’a pu être observée de manière notable.
Aussi, d'autres hypothèses ont été formulées et d’autres pistes ont été proposées et
explorées. Le capteur détectant toutes modifications intervenant dans l'épaisseur de la couche de liquide qu'il cisaille, nous avons réfléchi en particulier au fait que, en assimilant le système couche sensible-anticorps-bactéries à des éléments reliés entre eux de manière non rigide, il est possible que le mouvement lié à la propagation de l’onde sous ou au niveau de la couche
fonctionnalisée, ne se transmette pas jusqu’aux bactéries, car plus la rigidité augmente, plus
grande est la profondeur de pénétration de l'onde. Ainsi, en ne les mettant pas en mouvement,
l’onde ne serait pas modifiée par leur présence, sauf à partir d’un seuil, important, au-delà
duquel les différents éléments seraient suffisamment denses et donc proches pour constituer un tapis présentant une certaine rigidité pour être mis en mouvement.
Dans ce cas, l’utilisation d’additifs visant à modifier les propriétés viscoélastiques du
fluide, pour augmenter notamment la profondeur de pénétration de l'onde et ainsi améliorer la sensibilité du capteur et diminuer son seuil de détection, a été envisagée. Afin d’éprouver cette hypothèse, nous avons effectué dans un premier temps des tests d’influence de solutions
de PEG (Poly Ethylène Glycol), déjà étudiées dans la thèse de V. Raimbault [156] et dont les effets sur les ondes acoustiques sont désormais connus. Notre but était d'augmenter la profondeur de pénétration de l'onde acoustique sans perturbation du signal et surtout sans générer de pertes incompatibles avec le fonctionnement en oscillateur. Ainsi, comme le démontre l'étude théorique du chapitre 2 (équation (2- 57)) une augmentation de la viscosité du milieu entraîne une pénétration plus profonde de l'énergie acoustique, permettant ainsi de solliciter une plus grande épaisseur de liquide et de diminuer le seuil de détection du capteur. De plus, une étude sur l'impact de différentes solutions de PEG (masses moléculaires comprises entre 200 et 35000 g/mol) sur la réponse des capteurs, en termes de variations des pertes par insertion et de variations de fréquences en mode oscillateur, a été réalisée par V.
Raimbault (Figure 4-10) [156]. Elle démontre qu'à viscosité identique, les PEG de masses
moléculaires élevées influencent moins la réponse du capteur en termes de pertes par insertion et de fréquences en mode oscillateur.
S'il semble ainsi plus intéressant d'utiliser une solution de PEG visqueuse avec un PEG de masse moléculaire élevé, il est cependant nécessaire de déterminer l'impact de ces solutions sur les espèces biologiques en solution, leurs interactions mutuelles et leur cinétique d'accroche sur la couche fonctionnalisée du capteur et sur les cinétiques. Un compromis doit en effet être trouvé entre une solution assez visqueuse pour augmenter la profondeur de
pénétration de l'énergie acoustique, et une longueur des chaînes du PEG pas trop longue afin de favoriser les déplacements des espèces en solution.
a) b)
Figure 4-10 Variations expérimentales a) de pertes d'insertion b) de fréquence, avec le
capteur à ondes de Love muni d’un microcanal de 2000 m de large et de 50 m de hauteur
pour les solutions aqueuses de PEG, en fonction de 0 [156]
De ce fait, dans un premier temps, par souci de comparaison, nous avons réalisé des tests préliminaires de détection en régime statique en indirect avec différentes solutions de PEG (protocole DRSIPEG), puis, dans un second temps, des détections en régime statique en direct (protocole DRSDPEG) avec ces mêmes solutions de PEG. Pour ces tests, nous avons préparé des solutions de PEG de masses moléculaires et de concentrations massiques différentes, obtenues en dissolvant des copeaux de PEG dans une solution de tampon TBS:
• PEG 6000 à 5%, 10%, 15% ; • PEG 12000 à 10%, 20%;
• PEG 20000 à 2,5%, 5%, 10%, 20%; • PEG 35000 à 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 4%.
Le nouveau protocole DRSIPEG est le suivant:
Les étapes 1 à 8 sont identiques à celles du protocole statique en indirect du § 4.3.2, avec
greffage d’anticorps GAM γ et saturation par SBBB, ainsi que préparation de bactéries pré
incubées avec anticorps ACM4.
9. Ligne de base avec PEG: dans les cavités vides est injecté un volume de 125µL d'une