Les mutations du domaine hélicase d’Upf1 n’affectent pas ses interactions avec les

En parallèle des analyses en CRAC de la position d’Upf1, j’ai aussi analysé la composition des particules ribonucléiques (RNPs) en situation sauvage pour Upf1 et mutante aux différentes positions décrites précédemment. Nous avons purifié Upf1 et les versions mutantes dans des conditions similaires puis nous avons calculé les enrichissements des protéines comme décrit dans le chapitre précédent sur le développement méthodologique. L’expérience a été réalisée cinq fois pour Upf1 sauvage et au moins deux fois pour les mutants K436Q, TR800AA et C122S (Table 1). Pour les versions d’Upf1 surexprimées, trois réplicas ont été réalisés pour TAP-Upf1 et un seul pour le mutant DE572AA. Pour certains mutants, j’ai aussi réalisé des purifications avec un traitement RNase (Voir Matériels et Méthodes de l’article) afin d’éliminer les interactions non directes médiées par l’ARN.

J’ai procédé dans un premier temps à une analyse comparative des différents réplicas entre eux par un regroupement hiérarchique (Figure 22A). Nous avons observé que les réplicas des différentes conditions de purification sont plus proches entre eux que des autres expériences, ce qui a montré une bonne reproductibilité. On a remarqué une différence nette entre les expériences avec traitement RNase et celles sans le traitement, qui sont séparées dans deux branches bien distinctes de l’arbre. Seul le profil d’interaction du mutant C122S était plus proche des profils de purification avec traitement RNase. Ce résultat est corrélé avec les

Expérience NMD Niveau d’expression Nb réplicas Nb réplicas + RNase

Upf1-TAP + endogène 5 3 Upf1-K436Q-HTP - endogène 3 1 Upf1-TR800AA-HTP - endogène 3 0 Upf1-C122S-HTP - endogène 2 1 TAP-Upf1 + surexpression 3 0 TAP-Upf1-DE572AA - surexpression 1 0

expériences précédentes montrant une perte de l’interaction avec l’ARN de ce mutant. Parmi les expériences sans traitement RNase, les purifications des versions surexprimées d’Upf1 étaient groupées dans la même branche, le mutant K436Q avait un profil similaire à ceux des expériences avec Upf1 sauvage et le mutant TR800AA était dans une branche séparée plus proche des profils pour Upf1 sauvage et K436Q que des autres conditions.

Pour permettre une analyse plus précise des purifications, j’ai détaillé les interactions identifiées pour Upf1 sauvage puis je les ai comparées avec celles trouvées dans les conditions mutantes. Les résultats pour Upf1 sauvage (Figure 22B) sont représentés sous forme d’un graphique avec en abscisse l’intensité des protéines quantifiées en spectrométrie de masse et en ordonné l’enrichissement de ces protéines par rapport à un extrait total de levure. On a observé, comme attendu, un enrichissement des deux autres facteurs cœurs Upf2 et Upf3 parmi les facteurs les plus enrichis ce qui validait la méthode utilisée pour la spectrométrie de masse et son analyse. En outre, les deux protéines les plus enrichies avec Upf1-TAP ont été Nmd4 et Ebs1. Nmd4 a été décrit précédemment comme interagissant avec Upf1 dans un crible double hybride (He and Jacobson, 1995) puis très peu caractérisé. C’est une petite protéine de 25 KDa environ qui consiste presque uniquement en un domaine PIN. Ce domaine peut avoir une activité de liaisons à l’ARN, d’endonucléase ou être une interface pour des interactions protéine/protéine (Schneider et al., 2009). Ebs1 a été caractérisé en 2007, il est homologue de la protéine Smg7 humaine et pourrait avoir un rôle dans le NMD (Ford et al., 2006) ou dans la régulation de la traduction (Luke et al., 2007). Les protéines Dcp1, Dcp2 ainsi que Edc3, qui font parties du complexe d’hydrolyse de la coiffe ont aussi été retrouvées fortement associées avec Upf1-TAP purifié. Les autres facteurs enrichis étaient pour la plupart des protéines des liaisons aux ARNs. Parmi elles, on a remarqué quelques protéines particulières comme des caséines kinases (le complexe CK2 et la protéine Hrr25), la E3-ubiquitine ligase Ubr1 et le complexe Lsm1-7/Pat1.

Figure 22 : Upf1 muté au niveau de l’hélicase reste associé à ses partenaires

A. Regroupement hiérarchique des réplicas des expériences réalisées pour cette étude sur les mutants d’Upf1. TAP-Upf1-surexp et TAP-Upf1-DE572AA-surexp sont des échantillons dans lesquels la seule version d’Upf1, mutée ou non est exprimée à partir d’un plasmide centromérique sous le contrôle d’un promoteur tetO7 induisant une surexpression de 50 fois environ. J’ai utilisé une transformation de Ward qui minimise la variance entre les échantillons de chaque groupe pour réaliser le regroupement. B. Combinaison des données d’intensité des protéines quantifiées en spectrométrie de masse (abscisse) par rapport à l’enrichissement des protéines dans la purification par rapport à un extrait total (ordonné). Les axes utilisent une échelle logarithmique. C. et D. Graphique représentant pour chaque version d’Upf1 l’enrichissement des protéines d’intérêts. L’histogramme C. représente Upf1-TAP (gris), Upf1-K436Q (vert clair), Upf1-TR800AA (vert foncé) et Upf1-C122S (saumon). L’histogramme D. représente TAP-Upf1 (damier blanc) et le mutant Upf1-DE572AA (orange). La protéine utilisée pour la purification est représentée en gras sur l’axe des ordonnées. L’axe des abscisses utilise une échelle logarithmique.

Pour comparer les enrichissements entre les purifications d’Upf1 sauvage et les mutants, j’ai restreint mon analyse aux protéines les plus enrichies avec Upf1 sauvage identifiées ci-dessus. J’ai regroupé les protéines Lsm1 à 7 et Pat1, sous la dénomination LSM-PAT, leurs profils dans les différentes purifications étaient similaires et elles font partie d’un complexe déjà défini. Les résultats des comparaisons (Figure 22C et D) ont montré peu de différences entre Upf1 sauvage et les mutants K436Q, DE572AA et TR800AA pour le groupe de protéines étudiés. Il semble que ces trois mutants continuent d’interagir avec les mêmes protéines que la version sauvage. En revanche, le mutant C122S s’est comporté différemment. Il a perdu toutes ses interactions avec Upf2, Upf3 et la machinerie d’hydrolyse de la coiffe. Les interactions avec les protéines LSM-PAT sont aussi abolies ce qui semble se corréler avec la perte de l’interaction aux ARNs de la protéine. Seul l’enrichissement de Nmd4 n’a pas été affecté tandis que l’interaction avec Ebs1 a été perturbée. Ces résultats ciblés sur quelques protéines confirment l’analyse globale des données par clustering montrant que les mutants K436Q et la version WT d’Upf1 ont des profils très similaires au contraire du mutant C122S. Le mutant TR800AA est très similaire à Upf1 sauvage pour les interactions les plus fortes, comme K436Q, cependant une analyse étendue des facteurs sensibles à la mutation en utilisant Gene Ontology (GOterm) montre une perte plus importante des facteurs ribosomaux dans le mutant TR800AA que K436Q qui suggère un affaiblissement de la liaison à l’ARN

En condition stationnaire, il n’y a pas de différences majeures d’associations des protéines impliquées directement dans le NMD avec Upf1 sauvage ou mutée dans le domaine hélicase ARN. C’est assez surprenant puisque ces mutations abolissent complètement le NMD. La perte de fonction des versions mutantes pourrait alors être due à un défaut dans la dynamique d’action des différents facteurs autour d’Upf1. Une autre possibilité est que l’activité ATPase soit requise pour une étape tardive du mécanisme, par exemple le recyclage de Upf1 (Franks et al., 2010). Cela n’affecterait pas l’interaction avec les autres facteurs mais bloquerait les protéines Upf1 sur un ARN en empêchant leur réutilisation dans un autre événement de NMD. Pour comprendre le comportement de ces mutants, nous manquons de connaissances sur l’enchaînement des étapes conduisant à la dégradation des ARNs après reconnaissance des PTCs et sur le rôle exact de l’activité ATPase dans le mécanisme. L’équipe de Hervé Le Hir, avec qui nous collaborons, travaille sur la caractérisation de la fonction ATPase et hélicase de Upf1. Pendant une deuxième partie de ma thèse, je me suis donc intéressée à la dynamique d’assemblage des complexes autour d’Upf1.