L’échange allélique est effectué par une double recombinaison homologue entre les séquences homologues aux séquences encadrant le gène d’intérêt. La technique utilisée est celle développée par Quénée (298) . Elle repose sur l’utilisation d’un vecteur suicide, pEX100Tlink, incapable de se répliquer chez Pa. Il possède un site de clonage multiple, le gène bla3 qui confère une résistance à l’ampicilline et à la carbénicilline pour Pa et le gène
sacB qui induit une sensibilité au saccharose. Le produit du gène sacB est une enzyme
permettant de dégrader le saccharose; il en résulte un dérivé toxique pour la bactérie.
1) Échange allélique
Les fragments de 1 à 2 kb, correspondant aux séquences encadrant en 5’ et 3’ du gène d’intérêt, sont d’abord clonés dans le vecteur pEX100Tlink, puis la cassette aacC1 conférant une résistance à la gentamicine est insérée entre ces deux fragments. Cette cassette est encadrée de deux courtes séquences nucléotidiques, loxP, reconnues par la recombinase Cre qui permettra d’exciser le gène de résistance aacC1 une fois la double recombinaison sélectionnée. Ce vecteur est ensuite transféré dans la souche de Pa par conjugaison biparentale.
Figure 1 : Cartographies des plasmides pEX100Tlink et pUCGmlox
a. La conjugaison biparentale
La conjugaison biparentale est réalisée avec la souche d’E. coli S17.1 contenant le vecteur d’échange allélique. La souche d’E. coli et la souche de Pa sont cultivées jusqu’à la phase exponentielle de croissance puis mélangées et déposées, sans étalement, sur le milieu LB gélosé sans NaCl. Après une nuit à 37°C, la culture est reprise dans 1 mL du milieu LB et étalée sur le milieu PIA (Pseudomonas Isolation Agar) contenant de la gentamicine. Le vecteur pEX100Tlink ne pouvant se répliquer dans Pa (Figure 1), seules les souches ayant intégré la cassette aacC1 par simple ou double recombinaison homologue entre les séquences encadrant le gène d’intérêt pourront se développer sur ce milieu.
b. Sélection des clones « double recombinant »
L’évènement de recombinaison peut être simple ou double. Une simple recombinaison, entre une séquence encadrant le gène d’intérêt au niveau du plasmide et son homologue génomique entraîne l’insertion complète du plasmide pEX100Tlink, incluant les gènes bla et sacB, dans le génome. Chez ces clones simple recombinant (SR), le gène d’intérêt est reconstitué et non invalidé. Lors d’un évènement de double recombinaison homologue, un pour chaque partie encadrant le gène, le gène d’intérêt est remplacé par la cassette aacC1 sans incorporation des gènes bla et sacB dans le génome. Ce sont ces clones doubles recombinants (DR) que l’on cherche. En premier lieu, les clones recombinants, ayant incorporé dans leur génome la cassette aacC1, sont sélectionnés sur milieu PIA contenant de la gentamicine. La proportion
100 de clones DR obtenue est variable selon le gène ciblé, en raison des différents niveaux de compaction de l’ADN qui rendent des zones du génome plus ou moins accessibles à la recombinaison. Puis, les colonies sont contre-sélectionnées sur le milieu PIA avec 5% du saccharose grâce au gène sacB. Du fait de la toxicité qu’entraîne la présence de ce gène sur ce milieu, seuls les clones ayant éliminé sacB pourront se développer. Ceci se produit soit par réversion du premier événement de recombinaison, soit par un second événement de recombinaison conduisant à une souche DR. Ces clones contre-sélectionnés sont ensuite repiqués sur milieu PIA gentamicine pour éliminer les révertants et sur PIA cabénicilline afin de sélectionner les clones DR. Ces mutants par insertion/délétion, avec un profil double recombinant, sont vérifiés par PCR sur ADN génomique.
c. Excision de la cassette de résistance
Les clones DR sont électroporés avec le plasmide pCM157 portant un gène de résistance à la tétracycline et le gène codant la recombinase Cre. Cette enzyme reconnaît la séquence loxP et entraîne une délétion par une recombinaison entre deux sites loxP. Les clones transformants sélectionnés sur tétracycline sont ensuite cultivés en milieu LB liquide supplémenté en tétracycline afin de permettre l’expression de l’enzyme Cre et l’élimination du gène aacC1. Ensuite, on cure le plasmide pCM157 en réalisant plusieurs cultures en milieu LB liquide sans antibiotique. Enfin, les colonies sont repiquées sur milieu PIA, PIA tétracycline pour vérifier que le plasmide a été curé et sur milieu PIA gentamicine afin de sélectionner les clones ne possédant plus la cassette aacC1. L’excision de ce gène est vérifiée par PCR sur l’ADN génomique de ses mutants.
d. Mutagénèse tri-parentale : obtention de souches exprimant la
Green fluorescent protein (GFP)
Les souches de Pa d’intérêt ainsi que 2 souches de E. coli (une contenant le plasmide helper pRK2013, une souche S17 contenant le vecteur miniCTX-GFP) sont utilisées. Les 2 souches de E. coli sont étalées sous forme de goutte (30µL) sur des boîtes contenant un milieu LB sans sel pendant 2 heures. La souche de Pa est mise à incuber sous agitation à 300 rpm endant 2 heures à 42°C. Puis, 30 µL de milieu contenant la souche de Pa d’intérêt sont ajoutés sur la goutte contenant les souches de E. coli. Le temps de contact est de 4 à 6 heures. La goutte est récupérée avec 300 à 500 µL de LB liquide puis mise sous agitation à 200 rpm pendant 10 minutes à 37°C. Enfin 100 µL du mélange sont étalés sur milieu PIA (Pseudomonas isolation agar) supplémenté en Tétracycline (Tc200).