mRNP mStau1 : colocalisation avec divers partenaires protéiques

4.2.1. Pur-α

Stau est associée au réticulum endoplasmique, aux polyribosomes, aux microtubules et est présent dans le compartiment somatodendritique des neurones, tout comme la protéine Pur-α. Comme Stau, Pur-α est une protéine liant l’ARN et possèdant de nombreuses fonctions, allant de la régulation de la transcription à la localisation dendritique d’ARNm. Au-delà de cette même distribution, il a été démontré, par immunofluorescence et immunoprécipitation, que ces deux protéines faisaient partie de mêmes complexes protéiques (Ohashi, Koike et al. 2002; Johnson, Kinoshita et al. 2006). De plus, cette association persiste en présence d’EDTA, c’est donc dire que celle-ci n’est pas médiée par la présence de polyribosomes (Ohashi, Koike et al. 2002). L’importance d’une telle association n’a pas encore été démontrée.

4.2.2. FMRP

À ce jour, de nombreuses études de colocalisation et de coimmunoprécipitation ont montré la présence de FMRP au sein des complexes de Stau, tant chez la drosophile que dans les neurones d’hippocampes en cultures (Ohashi, Koike et al. 2002; Barbee, Estes et al. 2006; Ferrari, Mercaldo et al. 2007). Cette association est indépendante de l’ARN (Villace, Marion et al. 2004). De plus, la présence d’un tel complexe dans les cellules HEK293 démontre une certaine similarité entre les mRNP cellulaires et neuronaux (Villace, Marion et al. 2004). Malgré l’importance de ces deux protéines dans la traduction et le transport dendritique d’ARNm, le rôle d’une telle association n’a pas encore été déterminé. Le rôle de FMRP fut abordé plus en détail dans la section 2.3.6.

4.2.3. Barentsz

Comme nous l’avons mentionné, dBarentsz est une protéine co-localisant avec dStau et, tout comme celle-ci, elle est nécessaire à la bonne localisation de l’ARNm oskar dans l’ovocyte de la drosophile (van Eeden, Palacios et al. 2001).

Il fut donc de mise d’étudier si une telle association pouvait également se retrouver entre ces homologues chez d’autres espèces, ce qui représenterait un mécanisme de transport conservé au fil de l’évolution. Comme de fait, il fut démontré que mStau1 et mBarentsz font partie des mêmes complexes au sein des neurones d’hippocampes. Elles sont localisées principalement dans la région du réticulum endoplasmique périnucléaire, mais sont également présentes dans la région dendritique. Cette colocalisation est inversement proportionnelle à la distance dendritique parcourue. Il est intéressant de constater que cette association est médiée par la région homologue entre dBtz et mBtz et qui se situe à l’extrémité N-terminale de la protéine. Cependant, il ne s’agit pas d’une interaction directe, mais bien dépendante de l’ARN (Macchi, Kroening et al. 2003).

4.2.4. Phosphatase-1

Stau1 coimmunoprécipite et colocalise avec les trois isoformes de la protéine phosphatase-1, PP1α, PP1β et PP1γ (Monshausen, Rehbein et al. 2002; Brendel, Rehbein et al. 2004). Elle interagit directement avec la phosphatase via le motif RKVTF situé entre son dsRBD4 et dsRBD5, motif présent chez de nombreux substrats de la phosphatase. Cette interaction ne semble pas affecter l’activité intrinsèque de la phosphatase-1 (Monshausen, Rehbein et al. 2002). Plusieurs hypothèses sont mises de l’avant afin d’expliquer l’importance d’une telle interaction. Par exemple, la phophorylation de Stau, ou encore d’une autre protéine du complexe permettrait de moduler la structure du mRNP, sa localisation ou encore la traduction des ARNm présents.

4.2.5. Études par protéomiques des complexes ribonucléoprotéiques

de Stau1

Deux équipes ont entrepris d’identifier les facteurs protéiques présents au sein des complexes de Stau1 à l’aide d’études par spectrométrie de masse.

4.2.5.1. Caractérisation des complexes de Staufen1-TAP à partir des cellules HEK293T

Une première équipe a entrepris d’identifier les partenaires protéiques de Stau1 par protéomique en utilisant comme approche la purification d’affinité du complexe associé à Staufen1-TAP, exprimée dans les cellules HEK293T (Villace, Marion et al. 2004).

Ils identifièrent ainsi des protéines ribosomiques (P0, S4, S6, L6, L28), des éléments du cytosquelette (β-5-tubulin, α-internexine), des moteurs protéiques (chaine lourde de myosine), la nucléoline, l’hélicase A, des facteurs de traduction et de régulation (PABP1, hnRNPU, p-associated protein kinaseII, Ras GAP, IQGAP1) de même que hStau2.

Ils confirmèrent la présence des protéines S6, Nucléoline, PABP1, Hélicase A et β-tubuline, par coimmunoprécipitation, suivie de l’immunobuvardage de type western. De plus, ils identifièrent par immunobuvardage de type western la présence de d’autres protéines dans ce complexe, protéines non retrouvées dans l’étude de protéomique, mais ayant un grand potentiel d’association avec Stau1, soit les protéines de β-actin, α-tubulin, kinésine, dynéine, FMRP, Tau, Rac1 et cdc42. Dans chacun des cas, les protéines ne furent point retrouvées dans l’IP contrôle. De même, les protéines p115 et Calnexin, abondamment présentes dans le cytoplasme, ne figurèrent pas dans les IP.

Afin de s’assurer que l’interaction n’était pas médiée par l’ARN, ils effectuèrent à nouveau les études de coimmunoprécipitation, mais cette fois en traitant le lysat cellulaire à la RNase A. L’interaction de nombreuses protéines dont PABP1, Nucléoline et certaines

protéines ribosomiques fut ainsi abolie. Ces résultats sont en accord avec la seconde étude protéomique que nous aborderons plus tard. Cependant, il fut intéressant d’observer que l’interaction entre Stau1 et l’actine, la tubuline, tau, la dynéine et FMRP était toujours présente (Villace, Marion et al. 2004).

Transposition de l’étude dans un contexte neuronal

Une tentative en vue d’identifier certains partenaires protéiques neuronaux de Stau1 fut entreprise dans des neuroblastes humains, les SHSY5Y, différenciés à l’aide de l’acide rétinoique (Villace, Marion et al. 2004).

La colocalisation de Stau1 et des protéines préalablement identifiées, soit S6, L28, dynein, kinesine, IQGAP1, cdc42, rac1, nucléoline, hélicase A, PABP1 et FMRP fut confirmée. De plus, la colocalisation de Stau1 avec les microtubules, les neurofilaments et l’actin fut établie à l’aide de la tubuline et de tau, de l’internexine et de la phaloïdine, respectivement (Villace, Marion et al. 2004).

4.2.5.2. Caractérisation des complexes de Staufen1-PDZ à partir des cellules HEK293

Une seconde équipe identifia par protéomique les protéines isolées suite à la purification des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1. Purification effectuée à l’aide d’un protocole d’affinité dans lequel le domaine PDZ est reconnu par un peptide de 10 acides aminés liés aux billes de sépharose. Les complexes traités ou non à la RNase furent isolés à partir de cellules HEK293 exprimant la protéine de fusion Stau1-PDZ. Les protéines ainsi isolées furent identifiées par spectrométrie de masse. Les complexes de hnRNPK et de Sharpin furent également isolés pour fin de comparaison (Brendel, Rehbein et al. 2004).

L’interaction entre Stau1 et les protéines nucléoline, NFAR, β4-tubuline, kinesine1, certaines protéines ribosomiques, tant de la petite que de la grande sous-unité (L21, L10, L15, L14, S8, L7a, S3a, S6, S2, L6 et P0), hnRNPU et l’hélicase A (RHA) fut résistante au traitement à la RNase. Cependant, le traitement à la RNase diminua grandement la quantité de nucléoline associée à Stau1, comme ce fut le cas dans l’étude précédente. La très grande majorité de ces protéines ne furent point retrouvées dans les complexes de hnRNPK et de Sharpin, à l’exception de hnRNPU. Ce résultat suggère que Stau1 fait partie d’un complexe ribonucléoprotéique distinct (Brendel, Rehbein et al. 2004).

Les auteurs identifièrent également par immunobuvardage western d’autres protéines susceptibles de se retrouver en complexe avec Stau1, soit la kinesin, PABP, FMRP, la dynéine, α-tubulin et la phosphatase-1 (PP1). Encore une fois, la RNase abolit l’association entre Stau1 et PABP. Ce fut également le cas pour la dynéine, contrairement à la kinésine dont une fraction résista au traitement. Enfin, comme nous en avons déjà discuté l’association avec PP1α est ARN-indépendante.

Ils poussèrent l’analyse de l’association entre Stau1 et les protéines nucléoline, PP1 et P0 plus loin. Ils établirent dans un premier temps que les domaines de liaison à l’ARN de Stau1 et de nucléoline étaient nécessaires à leur interaction et que le domaine de liaison de Stau1 à PP1 se trouvait entre le dsRBD4 et le dsRBD5. Finalement, ils démontrèrent que le domaine de liaison de Stau1 à P0 et PABP semblait nécessiter le dsRBD4 (Brendel, Rehbein et al. 2004).