Les self-assembled-monolayers (SAM) représentent l’arrangement spontané d’entités moléculaires qui s’adsorbent sur une surface de manière très organisée. Les constituants de la SAM sont composés de trois parties : une extrémité proximale capable de former un lien très fort avec le support, un squelette interne souvent caractérisé par une chaîne hydrocarbonée, qui, grâce aux nombreuses interactions intermoléculaires, confère au système un arrangement très ordonné, et enfin une extrémité terminale possédant une fonction chimique utile à l’immobilisation du ligand. Les SAM les plus populaires sont formées par des alcane-thiols sur des supports en Au(111). Les thiols ont la particularité de posséder une très grande affinité pour l’or, et sont en effet chimisorbés avec une force de
liaison thiolate-or de 40-50 kcal.mol-1 selon le schéma réactionnel suivant130 :
1) Activation (NHS/EDC) 2) Ligand-NH2
fonction carboxylate
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R-SH + Au R-S-Au + ½ H2
Les SAM se forment par simple incubation d’une surface d’or dans une solution d’alcane-thiols. Bien que la phase de chimisorption soit rapide, le temps d’incubation est prolongé de plusieurs heures, afin de permettre aux sous-unités de se réarranger de manière optimale (Figure 20). Au final, les monocouches ont un niveau d’organisation tel, que les alcane-thiols (n ≥ 10) possèdent une structure cristalline homogène et compacte. Ces
propriétés permettent à la SAM d’orienter au mieux les biomolécules à immobiliser.131
Figure 20: Formation d'une SAM. Au cours du temps, les molécules se réorganisent en monocouche structurée. Les alcane-thiols forment un angle de 30° avec la normale à la surface.132
En fonction de la nature hydrophile ou hydrophobe de la surface que l’on souhaite avoir, ainsi que le type d’immobilisation voulu, les extrémités terminales peuvent être par exemple composées de fonctions -CH3, -CF3, -NH2, -OH, -COOH, -N3 ou -biotine. Les fonctions –COOH vont permettre de greffer les ligands via des couplages amines (paragraphe II.6.a), mais cette fois-ci, une surface 2D sera obtenue (Figure 21A), contrairement au greffage dans l’épaisseur d’une couche de polymère (dextran par exemple). Les SAM biotinylées vont quant à elles pouvoir accueillir des molécules de streptavidine qui viendront former une plateforme permettant l’immobilisation de ligands biotinylés (Figure 21C). Enfin, d’autres fonctions plus spécifiques telles que les fonctions azoture réagiront avec les ligands via des réactions de chimie-click afin de former des liaisons covalentes (Figure 21B). Pour un greffage efficace, l’accessibilité des groupements fonctionnels doit être assurée. Dans ce but, ils peuvent être co-adsorbés avec des fonctions inertes (-OH), formant ainsi des SAM « mixtes ». Par ailleurs, Whiteside et al. ont montré que les surfaces présentant une chaîne oligoéthylène glycol (OEG) entre la chaîne alcane et la fonction terminale sont résistantes à
47 Figure 21 : Fonctionnalisation sur SAM. A : via un couplage amine qui conduit à une liaison peptidique covalente ; B : via une réaction de chimie « click », ici la cycloaddition azoture-alcyne, qui conduit à une liaison covalente par lien triazole ; C : par une capture streptavidine (SA) / biotine qui correspond à une liaison non covalente. Les SAMs sont composées d’alcanethiols et d’oligoéthylène glycol (OEG). Dans les SAMs mixtes, les OEG portant la fonction terminale réactive sont généralement plus longs afin de faire émerger la biomolécule greffée. Les surfaces fonctionnalisées grâce aux SAMs ont une structure 2D.
De même que les alcane-thiols, les ligands possédant une fonction thiol sont capables d’interagir directement sur les surfaces d’or, sans nécessité de sous-couche intermédiaire.
C’est le cas par exemple de peptides contenant des cystéines.134 Dans ce cas, nous parlons
également de SAM. Cette procédure est toutefois moins utilisée car plusieurs problèmes liés aux charges, à une orientation moins correcte, où à la densité de surface peuvent
survenir.135
De nombreuses autres méthodes de fonctionnalisation existent. Leur choix est généralement crucial car il impactera très probablement les résultats obtenus par la suite. Il est donc important de tenir compte de la nature et des propriétés du ligand, la facilité avec laquelle nous pouvons le modifier, et l’orientation souhaitée. Les méthodes présentées ici permettent toutes d’obtenir un biofilm où chaque biomolécule est positionnée à un endroit spécifique. Il faut savoir qu’à l’inverse, il est possible de travailler avec des systèmes beaucoup plus fluides tels que les bicouches lipidiques supportées. Avec ce modèle de
1) Activation (NHS/EDC) 2) Ligand-NH2 Ligand-alcyne CuI Streptavidine (SA) Ligand-biotine alcanethiol ligand liaison peptidique (covalent) liaison triazole (covalent) capture SA/biotine (non covalent) A B C fonction terminale OEG
48 membrane plasmique, les biomolécules analysées peuvent se mouvoir sur la surface comme elles le feraient au travers de la bicouche lipidique d’une cellule. Dans notre cas, les systèmes figés, et plus particulièrement les SAMs, ont souvent été utilisés afin de mieux contrôler les densités surfaciques en biomolécules. Une fois la méthode choisie, il est
important de caractériser le greffage avec les techniques qui s’y prêtent.136
III. Présentation des travaux de thèse
L’objectif global du projet est de concevoir une surface antigénique dont les caractéristiques répondent aux critères de qualité présentés ci-dessus, puis de l’utiliser dans le but de mieux comprendre l’interaction CD20/rituximab.
Les résultats aideront à développer des mimes du paratope de l’anticorps rituximab, dont le faible poids moléculaire leur permettrait de pénétrer les tumeurs solides. Synthétisés de manière chimique, leur coût de production serait moindre, comparé à une préparation par voie biologique. Les mimes consisteront en l’assemblage de peptides correspondant aux séquences CDR du rituximab les plus impliquées dans la reconnaissance spécifique du CD20. Ces peptides doivent donc être préalablement sélectionnés avec soin. Des études réalisées avant le début de la thèse avec la technique SPOT ont déjà permis d’identifier plusieurs séquences potentiellement intéressantes pour le développement des mimes. Les premiers objectifs ont donc été de confirmer, et si possible, d’affiner ces résultats via l’utilisation d’autres techniques de caractérisation telles que la SPR ou le BLI.
Les travaux de thèse ont donc évolué vers quatre objectifs :
le développement contrôlé et la caractérisation d’une surface antigénique. Pour l’immobilisation de l’antigène sur la surface, notre choix s’est porté sur la réalisation d’un lien covalent formé par chimie « click ». Les conditions de cette réaction furent optimisées grâce à des expériences d’électrochimie. Les surfaces obtenues ont fait l’objet d’études, telles que la caractérisation de la densité surfacique en antigène.
la caractérisation de l’interaction CD20/rituximab. Des cinétiques d’interaction entre l’anticorps et l’antigène surfacique ont été menées dans le but, d’une part, d’évaluer la
49 spécificité et l’affinité du rituximab pour la surface fonctionnalisée avec le CD20, et d’autre part, d’étudier en détails les paramètres intervenant dans une interaction
antigène/anticorps.
le criblage de peptides du paratope, permettant la détermination fine du site actif de l’anticorps. Les peptides perçus comme ayant un haut potentiel d’intérêt via la méthode
SPOT ont été soumis à une 2ème analyse par SPR. L’ensemble des résultats a donné lieu à une
image très précise de la localisation de l’interaction du CD20 dans la poche du rituximab. Une comparaison des données inter-techniques a été réalisée.
le développement des mimes d’anticorps. La surface et la sélection des peptides étant réalisées, nous avons donc conçu des premiers mimes du RTX, soit en fusionnant deux séquences peptidiques en un seul et même peptide linéaire, soit en agençant les différents peptides sur un châssis moléculaire.
Figure 22 : Schéma global du projet de recherche, avec, en rouge, les tâches qui m’ont été confiées durant la thèse. châssis moléculaire agent cytotoxique ou fluorophore CD20 rituximab 2èmesélection (SPR) Cellule tumorale Développement d’une surface antigénique reconnaissance et destruction 1èresélection (méthode SPOT) Cellule tumorale
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Chapitre II
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