Modifications dans l’expression des quelques protéines du cytosquelette 129 

Le cytosquelette forme un réseau de filaments et microtubules. Les principaux constituants de ces filaments sont les protéines qui contrôlent la forme, organisent les cellules et leurs mouvements. Dans la structure de ce réseau, on trouve trois types de filaments protéiques, montrés sur la Figure 5.7 : des filaments minces et flexibles d’actine, et des filaments intermédiaires, des microtubules, structures cylindriques organisées autour du centrosome.

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Figure 5.7 La structure de réseau du

cytosquelette.

L’actine est une composante majeure du cytosquelette, impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires, comme la contraction, la mobilité, la division, les mouvements des organites. Les cellules se contractent en présence d’ATP, grâce à la formation de longs faisceaux de micro filaments qui traversent le corps cellulaire et se terminent dans des plaques denses à la base de la cellule. Ces faisceaux sont nommés fibres de stress, parce qu’elles se forment en réponse à l’application d’une tension mécanique. Les fibres de stress sont des microfilaments formés des molécules d’actine G (globulaire), assemblées en longs faisceaux (l’actine F), qui ont, entre autres, pour rôle l’attachement des cellules sur un support. Schober et al. [11] ont prouvé que l’interaction entre le système microtubulaire, constitué de quantités équimoléculaires de tubuline α et β, et le cytosquelette d’actine est un processus fondamental de la régulation de la formation des prolongations cytoplasmiques (filopodes) et de la mobilité cellulaire.

Dans notre étude expérimentale, parmi toutes les protéines du cytosquelette, nous avons étudié l’expression d’actine et de tubuline α. Les expressions de ces protéines sur les surfaces à analyser sont présentées sur les clichés de la Figure 5.8 et la Figure 5.9.

5.2.3.1. Evaluation de l’expression d’actine

La figure 5.8 présente l’expression d’actine dans le cytosquelette des fibroblastes développés sur la surface contrôle, les différentes surfaces de titane non revêtu et celles de titane revêtu de TiO2.

Ce marquage donne des indices sur la morphologie et l’orientation des cellules développées sur ces surfaces. Ainsi, sur les surfaces les plus lisses, telles que celles du contrôle et de l’échantillon T4000, les fibroblastes sont orientées aléatoirement, et présentent toutes une morphologie identique de cellule bien étalée. Microtubules Centrosome Filaments Filaments intermédiaires Noya

u

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Figure 5.8. Visualisation par microscopie confocale de l’expression d’actine-F dans le

cytosquelette des fibroblastes sur le contrôle, les échantillons de titane non revêtu (T1200 et T4000) et de titane revêtu de TiO2 par MOCVD (T9, T12, T13, T14, T15).

Les fibroblastes cultivés sur le titane non revêtu T1200 (plus rugueux que T4000) et sur les surfaces de TiO2 présentant différents degrés de rugosité, sont allongées et alignées

approximativement parallèles les unes aux autres. Meyle et al. [12] ont montré que les fibroblastes gingivaux sont orientés (phénomène de guidance contact) et qu’ils sont capables de modifier leur

Contrô

le

T4000 T9

T12 T13

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morphologie en fonction de la topographie de la surface des supports. Les surfaces rugueuses favorisent un alignement des cellules, observé aussi dans notre étude. De plus, les cellules développées sur titane non revêtu T1200, sur les échantillons T9 et T12 revêtus d’une couche compacte de TiO2, et

sur l’échantillon T14 où la couche, de structure colonnaire, est modérément rugueuse, ont des morphologies semblables, très allongées, avec de nombreux filopodes de longueurs variables. Sur les surfaces revêtues de TiO2, avec une morphologie colonnaire et les plus fortes rugosités (T13 et T15),

les fibroblastes gingivaux présentent un aspect fusiforme avec des filopodes allongés aux extrémités. Les filopodes contiennent des faisceaux de filaments d’actine et forment des contacts focaux qui assurent la communication des cellules avec le milieu extracellulaire et facilitent la mobilité cellulaire. Pour tous les échantillons, les filaments d’actine sont dispersés dans l’entière masse cytoplasmique. On distingue aussi des fibres de stress (des structures filiformes fortement fluorescentes) qui déterminent la forme des cellules, remodèlent la MEC et sont impliquées dans la mobilité cellulaire. A l’exception des échantillons à surface lisse (contrôle et T4000) où les fibres de stress, parallèles entre elles, sont distribuées au hasard, les fibres de stress sont alignées, sous l’effet des forces de tension exercées par les supports. De plus, les cellules développées sur titane revêtu du film de TiO2 le plus

épais (T13) présentent une concentration de filaments d’actine sous forme de clusters, moins des fibres de stress orientées parallèlement, ce qui suggère une perturbation des interactions avec le substrat.

Il est difficile d’utiliser l’expression d’actine F pour classer les échantillons sur la base des signaux de fluorescence obtenus. Pourtant, on peut affirmer que les supports qui paraissent affecter le réseau des filaments d’actine après leur concentration dans certaines régions sont T13 et, dans une moindre mesure, T12 et T14.

5.2.3.2. Evaluation de l’expression de la tubuline α

Les résultats de l’étude imunocytochimique de l’expression de la tubuline α et du marquage des noyaux au DAPI sont présentés sur la Figure 5.9. L’influence des caractéristiques micro- morphologiques des surfaces sur l’orientation des cellules HGF-1 apparaît clairement : les surfaces lisses (le contrôle et T4000) déterminent une distribution aléatoire des cellules, tandis que les surfaces plus rugueuses (T1200 et les échantillons de titane revêtu d’oxyde) déterminent une distribution unidirectionnelle.

Cette analyse immunocytochimique de l’expression de tubuline α montre des cellules pour lesquelles l’intensité du signal fluorescent est homogène sur l’ensemble du cytoplasme, et des cellules pour lesquelles ces signaux sont concentrés près du noyau (indice de la participation des microtubules à la mitose) ou

dans les prolongations cytoplasmiques (indice de la participation des

microtubules à la motilité cellulaire).

A l’exception de l’échantillon T4000, les filaments de tubuline α sont alignés dans une même direction sur tous les échantillons. Ils sont mieux exprimés sur les échantillons les plus lisses, T4000 et

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T9. Le plus faible marquage est observé pour les fibroblastes gingivaux cultivés sur l’échantillon revêtu de TiO2, T14.

Figure 5.9. Visualisation par microscopie confocale de l’expression de tubuline α dans le

cytosquelette des cellules fibroblastes sur le contrôle, les échantillons de titane non revêtus (T1200 et T4000) et de titane revêtus de TiO2 (T9, T12, T13, T14, T15).

Contrôle T1200

T14

T15

T4000 T9

T12 T13

134

L’examen de l’expression de deux protéines du cytosquelette des fibroblastes gingivaux, l’actine et la tubuline α, a conduit aux conclusions suivantes :

- les fibroblastes gingivaux s’orientent et modifient leur morphologie en fonction de la topographie de surface du support : les surfaces rugueuses (T1200 et titane revêtu de TiO2) favorisent

un alignement des cellules, tandis que les surfaces plus lisses (contrôle et T4000) favorisent une distribution aléatoire ;

- les filaments d’actine sont dispersés dans l’ensemble de la masse cytoplasmique ; on trouve également des fibres de stress : sur les échantillons à surface rugueuse (Ti1200 et titane revêtu de TiO2), ces fibres sont alignées sous l’effet de forces de tension exercées par le substrat sur les cellules ;

sur T13 et, dans une moindre mesure, sur T12 et T14, leur organisation est perturbée;

- l’examen de l’expression de la tubuline α conduit à des observations similaires : à l’exception du contrôle et de l’échantillon T4000, les filaments de tubuline α sont distribués selon une seule direction sur tous les échantillons étudiés. L’expression est maximale sur T4000 et T9 ; le marquage le plus faible est observé sur l’échantillon T14.