Généralités sur les fibroblastes et les ostéoblastes 117

Avant de présenter les résultats des études in vitro, nous présentons quelques généralités sur ces deux types de cellules : les fibroblastes et les ostéoblastes.

5.1.1. Fibroblastes

Les tissus conjonctifs fibreux sont des tissus de soutien composées d’un nombre réduit de cellules (fibroblastes et mastocytes) et de fibres (collagène, élastine), et d’une grande quantité de substance extracellulaire (substance basale de la MEC). Les tissus conjonctifs sont séparés des cellules épithéliales par la couche basale (Figure 5.1).

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Figure 5.1. Schéma d’un tissu conjonctif :

1 – cellule épithéliale 2 - macrophages 3 - fibres élastiques 4 - mastocite 5 - fibres de collagène 6 - glycosaminoglycannes 7 - capillaire 8 - fibroblaste 9 - couche basale

Les fibroblastes (FB) ont un rôle essentiel dans le développement de l’organisme. Leur

fonction principale est de maintenir l’intégrité structurale des tissus conjonctifs par la sécrétion continue des précurseurs de la matrice extracellulaire. Ce sont donc des cellules au métabolisme intense. Ce type de cellules présente des terminaisons cytoplasmiques qui leur permettent de se déplacer et de se reconnaître entre elles. Par rapport à d’autres types cellulaires, les FB en culture ont la capacité de maintenir leur morphologie. Un des caractéristiques des cultures de FB normaux est la formation d’une structure monocouche grâce à l’inhibition de contact. La morphologie des FB peut varier en fonction de la nature du substrat sur lequel elles adhèrent et de la surface disponible pour leur déplacement et leur division.

Les FB se présentent sous deux formes, avec des particularités morpho-fonctionnelles distinctes : les fibroblastes actifs (impliqués dans des processus métaboliques spécifiques) et les fibroblastes inactifs, nommés fibrocytes (des FB en repos fonctionnel). Les FB sont impliqués dans la cicatrisation des lésions tissulaires : les endommagements du tissu stimulent les fibrocytes et provoquent la division cellulaire.

La matrice extracellulaire (MEC) est une structure dynamique qui joue un rôle essentiel

dans le développement, la migration, la prolifération et la fonction métabolique des cellules avec lesquelles elle se trouve en contact permanent. Les macromolécules constituantes de la MEC sont secrétées par les cellules dispersées dans la matrice, principalement les fibroblastes. La MEC contient des polysaccharides – glycosaminoglycanes (GAG) qui sont en général liés de manière covalente à des protéines, formant des protéoglycans. La deuxième composante de MEC est constituée de deux types de protéines fibrillaires (collagène et élastine) et de protéines d’adhérence (fibronectine et laminine).

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Les protéines fibrillaires, disposées en réseau, sont responsables de l’organisation de la matrice, et de sa cohésion. Ce réseau protéique est englobé dans un gel hydraté de polysaccharides. La solution aqueuse du gel permet la diffusion de métabolites dans l’espace inter-cellulaire et dans les capillaires sanguins.

5.1.2. Ostéoblastes

Les ostéoblastes sont les cellules du tissu osseux. Ce tissu contient quatre type de cellules: i) les ostéoblastes, ii) les ostéocytes, iii) les ostéoclastes et iv) les cellules bordantes (cellules BL) qui couvrent la surface de l’os.

Les ostéoblastes sont les cellules majoritaires qui forment l’os et synthétisent les protéines de

la matrice osseuse, contrôlent la minéralisation du tissu, présentent des récepteurs pour la vitamine D, les estrogènes et l’hormone parathyroïdienne, secrètent des facteurs avec lesquels ils communiquent avec d’autres types cellulaires (par exemple, les facteurs qui activent les ostéoclastes). Un produit de synthèse d’ostéoblastes est le collagène de type I. Les ostéoblastes qui forment l’os produisent aussi l’ostéocalcine et l’ostéonectine qui constituent 40 à 50% de toutes les protéines non-colagéniques de l’os. D’autres protéines (ostéopontine, sialoprotéeine, fibronectine, vitronectine) sont des composants de la MEC auxquels se lient les intégrines.

Les ostéoblastes matures sont essentiels pour la minéralisation de l’os, le processus de dépôt d'hydroxyapatite ; ils contrôlent les concentrations en calcium et en phosphate. Dans les ostéoblastes on trouve des quantités relativement grandes de phosphatase alcaline, à la surface externe de membrane plasmique. Le rôle de la phosphatase alcaline est considéré comme primordial dans la minéralisation de l’os, mais le mécanisme reste encore méconnu. La minéralisation de l’os est produite à une distance de 8 à 10 µm des ostéoblastes. La synthèse de MEC détermine le volume de l’os mais non sa densité. La minéralisation augmente la densité de l’os en remplaçant l’eau, mais ne modifie pas le volume. Une fois leur fonction remplie, les ostéoblastes peuvent avoir trois destins :

a) une série d’ostéoblastes sont englobés dans la matrice extracellulaire, puis différenciés en cellules matures – ostéocytes – qui ont un rôle de capteurs de la pression mécanique exercée par la masse corporelle, en secrétant des facteurs de croissance qui activent les cellules bordantes ;

b) d'autres ostéoblastes restent à la surface du nouvel os et se transforment en cellules bordantes ; c) le reste des ostéoblastes disparaît par apoptose.

Les ostéocytes sont les cellules encapsulées dans les lacunes de la matrice minéralisée. Ces

cellules sont caractérisées par une morphologie en étoile. Dix fois plus nombreux que les ostéoblastes, ils représentent le type de cellules osseuses le plus nombreux. Leur distribution est régulée dans la matrice minéralisée et la communication entre eux est réalisée à travers les extensions de la membrane plasmique. Ce type cellulaire est capable de détecter le besoin de croissance osseuse dans le cas d’une

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inadaptation fonctionnelle du squelette ou d'endommagements au niveau du tissu. Ils sont sensibles aux changements de flux du fluide interstitiel.

Les cellules bordantes. La surface d’un os normal est recouverte d'une couche épaisse de 1 à

2 µm d'une matrice collagénique déminéralisée, sur la surface de laquelle existe une couche des cellules allongées : les cellules bordantes.

Les ostéoclastes sont des cellules impliquées dans la résorption du tissu osseux en utilisant

leur capacité de secréter des acides et des enzymes. Les ostéoclastes matures sont des cellules de grande taille (50 – 100 µm de diamètre) multi-noyaux. Ils ont comme caractéristique un système complexe de microvillosités au contact de la zone de la matrice osseuse calcifiée et capable de secréter de l'acide chlorhydrique qui permet la dissolution des cristaux de phosphate de calcium.

5.1.3. L’adhérence des cellules sur un substrat

Les cellules en culture adhèrent entre elles et sur le support sur lequel elles ont été placées. L'adhérence au support se fait par des contacts nommés contacts focaux (Figure 5.2.a). Au niveau de ces contacts, les extrémités de filaments d’actine sont connectées aux intégrines (glycoprotéines transmembranaires) qui peuvent lier des composantes de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine, la laminine ou la vitronectine. La connexion entre actine et intégrine est assurée par un complexe incluant plusieurs protéines : actinine, vinculine, taline, tenuine et paxiline.

Figure 5.2. Schéma d’une adhérence focale et les protéines impliquées dans ce processus (gauche) ; schéma de

l’interaction d’une protéine contenant une séquence RDG, avec un récepteur α-β intégrine provenant de la membrane cellulaire (droite): a) cytosquelette ; b) actine, vinculine, taline ; c) membrane cellulaire ; d) intérgrines α-β e) protéines avec séquence RGD

Les intégrines se comportent comme des récepteurs qui passent l’information reçue de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule (Figure 5.2.b). L’adhérence cellulaire, le contour, la mobilité et l’expression génétique dépendent de ces informations. Les intégrines reconnaissent les séquences

a b c

e d

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RGD (Arg-Gly-Asp) et se lient aux proteines qui contiennent ces séquences d’aminoacides (fibronectine, laminine ou vitronectine).

Une étude de l’adhérence cellulaire sur un support doit donc comprendre une évaluation de l’expression des proteines à trois niveaux : protéines extracellulaires, protéines transmembranaires et protéines cytoplasmiques.

Dans notre étude, afin de tenter de comprendre l’influence de la surface d’un biomatériau sur les cellules, des cultures des fibroblastes et d’ostéoblastes ont été réalisées sur les films d’oxydes de titane obtenus par MOCVD et par oxydation anodique.