LES MODELES D’ETUDE DU VHB

Ce qui suit est extrait en partie d’un chapitre de livre sur l’hépatite B écrit au cours de ma thèse.

Comme nous l’avons vu précédemment, les thérapies anti-VHB se sont considérablement améliorées ces dernières années avec à la mise au point des analogues de nucléos(t)ides. Ceci a pu se faire notamment grâce au développement de modèles d’études qui ont permis de tester l’activité de ces molécules mais aussi d’étudier les résistances développées chez les patients traités à long terme. De plus, notre connaissance de la patho-biologie de l’infection par le VHB provient d’études cliniques mais aussi des travaux réalisés à l’aide de modèles animaux. L’utilisation des modèles animaux tels que le canard de pékin, la marmotte américaine ou le tupaïa belengri a permis de grandes avancées dans la compréhension de l’infection par le VHB.

A. LES MODELES D’ETUDE ACELLULAIRES

Comme la polymérase virale est une enzyme clef de la réplication du VHB, des systèmes acellulaires ont été mis au point pour étudier son activité. Les efforts de la recherche dans ce sens sont particulièrement importants puisqu’à l’heure actuelle la structure tridimensionnelle de la polymérase virale n’est pas connue. Ceci freine considérablement le développement de composés antiviraux dirigés contre cette enzyme. Les systèmes acellulaires ont donc été développés pour étudier les composants virologiques et cellulaires utilisés lors de la reverse transcription ainsi que pour déterminer le mécanisme d’action des inhibiteurs de la polymérase virale tels que les analogues de nucléos(t)ides.

1. Expression de la polymérase virale en cellules d’insectes

La polymérase virale peut être exprimée grâce à un baculovirus dans des cellules d’insectes puis purifiée par chromatographie d’affinité. Dans ce modèle, il a été montré que la polymérase est associée à de l’ADN VHB de polarité négative et qu’elle exerce une activité de transcription inverse dans des essais de polymérisation in vitro (Lanford et al., 1995). De plus, ce modèle a, par exemple, été utilisé pour déterminer l’activité de l’Adéfovir contre les mutants du VHB résistant à la Lamivudine en comparant les constantes d’inhibition des polymérases sauvages et mutantes vis-à-vis de chacun des deux analogues de nucléos(t)ides (Xiong et al., 1998).

2. Utilisation de polymérase endogène

Un deuxième système basé sur l’utilisation de la polymérase virale endogène contenue dans des nucléocapsides purifiées a été développé. C’est notamment grâce à ce modèle qu’a pu être

déterminé l’impact de certaines substitutions nucléotidiques dans la polymérase virale dans le contexte d’une thérapie à base d’Entécavir (Tenney et al., 2004).

3. Expression de la polymérase du DHBV en lysat réticulocytaire de lapin

Enfin, il existe un dernier modèle acellulaire basé sur la polymérase virale du virus de l’hépatite B du canard (DHBV). Dans ce système, la polymérase active du DHBV est produite en lysat réticulocytaire de lapin (Wang & Seeger, 1992) puis utilisée pour étudier son activité de transcription inverse. Comme ce système permet à la fois l’initiation et l’élongation du brin d’ADN viral de polarité négative, il peut servir à déterminer le mécanisme d’action d’une molécule antivirale triphosphate (Zoulim et al., 1996). De plus, il a aussi permis de réaliser des études sur l’activité de polymérases virales portant des mutations de résistances aux antiviraux. En effet, après transfert par mutagénèse dirigée des mutations de résistances observées dans la polymérase du VHB dans celle du DHBV, des études ont été réalisées pour déterminer leur effet sur l’activité de la polymérase ou encore l’effet d’une molécule inhibitrice donnée sur la polymérase mutante (Jacquard et al., 2006, Le Guerhier et al., 2000, Seigneres et al., 2001, Seigneres et al., 2002).

Comme nous allons le voir, l’effet inhibiteur des analogues de nucléos(t)ides a été également étudié dans des systèmes de culture cellulaire et les résultats obtenus ne sont pas toujours de la même amplitude que dans les systèmes acellulaires (Brunelle et al., 2005, Jacquard et al., 2006, Seigneres et al., 2002). Ceci montre qu’il est aussi important de tenir compte de la métabolisation des analogues de nucléos(t)ides au sein d’une cellule dans l’évaluation de leur activité antivirale. Il est donc primordial de disposer de systèmes in vitro permettant d’étudier la réplication du VHB dans des cellules en culture.

B. LES MODELES D’ETUDE CELLULAIRES

Le modèle d’étude in vitro « idéal » devrait mimer une infection in vivo et permettre ainsi d’investiguer tous les aspects du cycle de réplication du VHB. Malheureusement, la mise au point d’un tel modèle s’est révélée très difficile en raison notamment de l’étroite spécificité d’hôte des hepadnavirus et de leur tropisme essentiellement hépatocytaire.

1. L’infection de cultures primaires

Le modèle le plus pertinent pour étudier le VHB est l’infection d’hépatocytes humains in vitro. Des travaux ont montré que la mise en culture d’hépatocytes primaires humains et leur infection mènent à la réplication du VHB (Galle et al., 1994, Gripon et al., 1988). Cependant, l’efficacité de l’infection est réduite et les hépatocytes primaires humains deviennent, très rapidement après leur mise en culture, non permissifs à l’infection par le VHB. De plus, les difficultés pour accéder à ces cellules, leur qualité variable (elles sont la plupart du temps issues de zones saines

de foie de patients opérés pour une ou plusieurs métastases hépatiques) ainsi que leur faible longévité en culture rendent très fastidieuse l’utilisation de ce modèle.

Par contre, les cultures primaires d’hépatocytes d’animaux tels que le canard de pékin, la marmotte américaine ou le tupaïa belangeri sont plus couramment utilisées. Elles permettent une réplication complète du virus de l’hépatite B qui leur est associé et représentent ainsi des modèles d’étude des différentes étapes du cycle viral et d’évaluation de composés antiviraux (Dandri et al., 2001, Hantz & Zoulim, 2004, Kock et al., 2001). Bien que plus répandues que les cultures primaires humaines, l’accessibilité aux cultures primaires animales reste toutefois limitée à des laboratoires associés à des centres vétérinaires.

Enfin, qu’il s’agisse de cellules primaires humaines ou animales, l’accès au matériel biologique est guidé par des aspects éthiques qui limitent les expériences.

2. La transfection transitoire de lignées d’hépatomes

Pour palier aux difficultés liées aux cultures primaires mentionnées ci-dessus, différents travaux ont menés à la mise en place de modèles d’étude du VHB utilisant des lignées cellulaires hépatiques humaines. Les cellules HepG2 et HuH7, qui sont le plus communément utilisées, sont issues de foie de patient présentant un CHC (Figure 43). Ces lignées ont été très bien caractérisées et sont considérées comme étant assez bien différenciées puisqu’elles expriment un panel assez large de gènes spécifiques du foie et sécrètent la plupart des protéines plasmatiques (Knowles et al., 1980, Nakabayashi et al., 1982).

Figure 43 : Photos au microscope optique de cellules HuH7 et HepG2

Cependant, contrairement aux lignées de cellules hépatiques non transformées, les lignées d’hépatomes HuH7 et HepG2 semblent avoir un problème au niveau du fonctionnement de la voie IFN. En effet, il a été montré que ces cellules ont une capacité assez faible à produire des IFN de type I en réponse à une infection avec le virus influenza ou avec le virus Sendai. De plus, des doses élevées d’IFN-α (>1000 IU/mL) sont nécessaires pour observer une augmentation des transcrits des ISG comme MxA ou OAS ainsi qu’un effet antiviral contre le virus de la grippe, le virus Sendai ou encore le virus de la stomatite vésiculeuse (Keskinen et al., 1999, Melen et al., 2000). Des travaux plus récents ont également montré que ces cellules ont une capacité faible, voir nulle, à répondre à une stimulation avec du polyIC, que celle-ci soit extra ou intracellulaire. Cette capacité est cependant

restaurée dans les cellules HuH7 où TLR3 est exprimé de façon ectopique, suggérant que le problème se situe plutôt au niveau des senseurs de l’infection virale (Li et al., 2005).

L’infection des cellules HuH7 et HepG2 par inoculation directe de virions VHB n’est pas possible. Des systèmes utilisant des méthodes de transfection du génome VHB ont donc été développés pour contourner l’étape d’entrée du virus dans la cellule et obtenir ainsi une réplication efficace du VHB. Différentes méthodes ont été mises au point pour délivrer dans les cellules un génome VHB compétent pour sa réplication.

Transfection sans vecteur

D’une part, une approche « sans vecteur » a été développée. Cette méthode consiste à amplifier le génome entier du VHB grâce à une PCR originale et efficace (Gunther et al., 1995). Les produits de PCR obtenus sont ensuite digérés par une enzyme de restriction dont le site de reconnaissance se trouve sur les oligonucléotides utilisés comme amorces pendant la réaction d’amplification. Ils sont alors transfectés dans des lignées d’hépatomes (HuH7 ou HepG2) où ils peuvent se circulariser grâce aux enzymes de la cellule hôte et ainsi servir de matrice à la transcription des ARN viraux. Ce système, où tous les intermédiaires de réplication du VHB sont détectables, a notamment permis de réaliser des études très intéressantes sur les modifications épigénétiques qui régulent la transcription à partir de l’ADNccc (Pollicino et al., 2006).

Cependant, les niveaux de réplication du VHB obtenus avec ce modèle de transfection sans vecteurs peuvent parfois être très bas et notamment lorsque les souches du VHB analysées possèdent des mutations spécifiques dans la polymérase virale (Villeneuve et al., 2003). Pour utiliser ce système dans le cas d’isolats cliniques à partir de sérum de patients, il faut donc le coupler à des méthodes de détection de la réplication du VHB sensibles telles que les PCR quantitatives en temps réel.

Cette approche « sans vecteur » reste toutefois intéressante puisque l’ensemble de la population virale d’un échantillon donné est représentée dans les produits de PCR transfectés (si l’on considère qu’il n’y a pas de biais lors de l’amplification) et la réplication du VHB est sous le contrôle de ses promoteurs naturels.

Transfection à l’aide de vecteurs

D’autre part, il existe des approches qui utilisent des vecteurs plasmidiques pour délivrer le génome VHB dans les cellules d’hépatomes. Lors de la transcription à partir de l’ADN circulaire clos du VHB, il y a formation d’un ARN pré-génomique qui va servir de matrice dans la capside virale à la polymérase virale pour former l’ADN relaché circulaire contenu dans les virions infectieux. Or comme l’ARN pré-génomique a une taille de 1,1 unités de génome, il faut insérer au moins 1,1 unités de génome VHB dans les vecteurs de transfection pour obtenir une réplication du VHB. De plus, la synthèse de l’ARN pré-génomique peut être sous le contrôle des promoteurs naturels du VHB (pour les insertions supérieures à 1,3 unités de génome VHB) ou sous le contrôle de promoteurs forts hétérologues (pour les vecteurs contenant 1,1 unités de génome).

Ces systèmes de transfection ont permis des avancées majeures dans la compréhension du rôle des protéines du VHB et notamment en ce qui concerne les protéines de l’enveloppe du virus. De plus, ils ont aussi permis d’étudier les éléments qui régulent l’expression du VHB (promoteurs, enhancers…) et sa réplication (Seeger & Mason, 2000).

Des analyses phénotypiques chez les patients ayant développé des résistances aux analogues de nucléos(t)ides sont également possibles grâce à ces techniques. La 1ère génération d’essais phénotypiques utilisait des plasmides où les génomes mutants étaient insérés par échange de cassette ou mutagénèse dirigée sur un plasmide contenant le génome VHB (Allen et al., 1998, Melegari et al., 1998b, Seigneres et al., 2002). Bien que ces essais aient permis de montrer que les mutants sélectionnés lors des thérapies étaient bien la cause de la résistance au traitement observée chez les patients, ils ne tenaient pas compte de la variabilité du génome entier des souches mutantes et pouvaient créer des génomes chimériques (spécialement dans le cas de génotypes différents). Des essais phénotypiques de deuxième génération ont vu le jour plus récemment (Figure 44). Ceux-ci permettent le clonage des génomes VHB à partir du sérum des patients dans des vecteurs plasmidiques (Durantel et al., 2004, Yang et al., 2004). Outre le fait que les niveaux de réplication du VHB soient meilleurs, ces méthodes permettent aussi de cloner l’ensemble de la quasi-espèce présente chez un patient donné et semblent donc plus appropriées pour étudier des situations virologiques complexes (Villeneuve et al., 2003).

Figure 44 : Principe des tests de phénotypage Figure d’après (Durantel et al., 2004)

Les principaux désavantages de ces systèmes de transfection sont le manque de reproductibilité et les faibles niveaux de réplication du VHB obtenus. En effet, seule une minorité des cellules reçoivent et expriment l’ADN du VHB lors d’une transfection. En conséquence même si la réplication du VHB peut être suivie, les effets de cette réplication sur la cellule hôte sont très difficiles

HBV HBV proteinsproteins DNA DNA intermediate intermediate Transcription Transcription mRNA mRNA pgRNApgRNA

protéines HBV ADN intermédiaire Transcription ARNm ARNpg pTriexModHBV type I souches HBV de laboratoire • sauvage • mutantes souches VHB de patients • sauvage • mutantes ou Kbp 2 1.5 3 1.2 1.0 DS Drug Drug SS Kbp 2 1.5 3 1.2 1.0 DS Drug Drug SS

sensibilité aux antiviraux

transfection transitoire

analogues de nucléos(t)ides

à observer puisque la majorité des cellules ne répliquent pas le virus. De plus, la réplication du VHB est transitoire car l’ADN transfecté est progressivement perdu (en raison des divisions cellulaires et de la dégradation de l’ADN plasmidique) ce qui rend impossible l’étude des effets potentiels du VHB à long terme.

3. Les lignées cellulaires exprimant le VHB de façon stable

Pour obtenir des résultats plus reproductibles, des lignées de cellules exprimant le génome du VHB de façon constitutive ont été construites.

La lignée HepG2.2.15 est issue par exemple de la transfection stable de cellules HepG2 (Sells et al., 1987). Elle produit de façon continue des virions complets du VHB. Ces cellules sont très utilisées dans les laboratoires pour obtenir des stocks de virions VHB infectieux. De plus, il a été montré que ces cellules ont un défaut d’expression de certains ISG (dont MxA par exemple) qui peut être partiellement restauré par un traitement à la Lamivudine (Guan et al., 2007). Le fait que cette restauration ne soit que partielle suggère deux hypothèses : soit la synthèse continue des protéines du VHB (qui a lieu même si la réplication est bloquée par la Lamivudine) maintient l’inhibition résiduelle de la voie IFN, soit les cellules HepG2.2.15, qui ont été sélectionnées pour répliquer le VHB de façon efficace, ont un défaut intrinsèque dans la voie IFN.

Différentes équipes ont ensuite construit des lignées exprimant de façon stable des souches du VHB mutantes afin de cribler de nouveaux antiviraux et de produire des virions VHB mutants (Fu & Cheng, 2000, Ladner et al., 1998).

L’un des principaux inconvénients de ces lignées stables réside dans le fait que le début de la réplication du VHB ne peut pas être contrôlé puisque celle-ci s’effectue en continue. Récemment, une équipe allemande a donc mis au point des lignées stables HuH7 et HepG2 où la réplication du VHB est sous le contrôle de la tétracycline (Sun & Nassal, 2006). Outre leur intérêt pour le test de nouveaux antiviraux, ces lignées inductibles permettent aussi d’étudier les relations virus-cellules lors de la réplication du VHB (Christen et al., 2007).

4. La transduction de lignées d’hépatome

Par ailleurs, il existe d’autres systèmes in vitro qui utilisent des adénovirus ou des baculovirus recombinants pour délivrer le génome VHB de façon efficace dans des cellules hépatiques (Delaney & Isom, 1998, Ren & Nassal, 2001).

Les baculovirus infectent les insectes. Ce sont des virus enveloppés contenant un génome sous forme ADN double brin circulaire clos superenroulé de 90 à 180 kb qui compte entre 120 et 160 ORF. Il existe deux types de virions ayant des morphologies différentes qui sont produits lors de la réplication des baculovirus (Figure 45). Les virions bourgeonnants sont des bâtonnets enveloppés de 30 à 60 nm de diamètre et de 250 à 300 nm de long et les virions inclus dans la matrice protéique cristalline qui forment des corps d’inclusion protéique d’environs 0,1µm dans lesquels sont

imbriquées plusieurs nucléocapsides entourées par une enveloppe commune. Les virions inclus initient l’infection au niveau de l’épithélium intestinal des larves d’insectes tandis que les virions libres assurent la dissémination de cellules à cellules à travers l’hôte. Le cycle de réplication des baculovirus est assez complexe et se caractérise par la succession de trois phases durant lesquelles différents sous-ensembles de gènes vont être exprimés. Au terme d’une multiplication de virus particulièrement abondante, les baculovirus provoquent la mort de leur hôte suite à la lyse de ces cellules (Durantel, 1998).

Figure 45 : Les deux formes de particules baculovirales

Les baculovirus sont aussi capables d’entrer dans différents types de cellules de mammifères (Condreay et al., 1999, Sandig et al., 1996, van Loo et al., 2001) et notamment de façon particulièrement efficace dans les cellules hépatiques (Hofmann et al., 1995). Une étude récente a montré que les baculovirus pénètrent dans les cellules HepG2 par un mécanisme d’endocytose médié par la clathrine (Figure 46) (Matilainen et al., 2005).

Figure 46 : Entrée des baculovirus dans les cellules HepG2 Figure extraite de (Matilainen et al., 2005)

Après pénétration dans les cellules de mammifères, les baculovirus ne se répliquent pas mais peuvent délivrer un transgène au noyau (Condreay et al., 1999, Sandig et al., 1996, van Loo et al., 2001). Ces virus peuvent être manipulés facilement, provoquent peu (voir pas) d’effets cytopathiques dans les cellules de mammifères et peuvent contenir de larges insertions d’ADN étranger (Kost & Condreay, 2002). Ils constituent donc d’excellents vecteurs et représentent une bonne alternative aux systèmes de transfection souvent peu efficaces en termes de nombre de cellules transfectées et de reproductibilité d’une expérience à l’autre.

ADN

nucléocapside enveloppe

Le système qui a été développé pour l’étude du VHB est basé sur l’utilisation du baculovirus Autographa californica comme vecteur pour délivrer efficacement un génome VHB (de 1,3 unités de génome) dans des cellules HepG2 (Delaney & Isom, 1998). Il présente plusieurs avantages comme (i) la capacité d’initier de forts niveaux d’expression du VHB (supérieurs à ceux observés avec un système de transfection), (ii) un contrôle précis et reproductible du niveau d’expression de VHB, (iii) la possibilité de détecter rapidement les intermédiaire de réplication du VHB à partir d’un faible nombre de cellules. De plus, ce système permet aussi de détecter l’ADNccc, ce qui est généralement difficile dans les lignées cellulaires transfectées de façon stable par le génome VHB. Enfin, contrairement aux lignées stables non inductibles, le début de l’infection peut être contrôlé, ce qui offre la possibilité de réaliser des traitements antiviraux avant ou pendant la transduction pour bloquer la réplication virale à différents stades (Delaney et al., 2001, Delaney et al., 1999).

5. L’infection de cellules HepaRG

Tous les systèmes de transfection et de transduction de lignées d’hépatome décrits précédemment permettent uniquement d’étudier les étapes post-transcriptionnelles du cycle du VHB puisque jusqu’à récemment aucune des lignées hépatocytaires disponibles n’était susceptible à l’infection directe par le VHB.

En 2002, une lignée de cellules hépatiques humaines immortelles (mais non cancéreuses), appelée HepaRG, a été obtenue à partir d’un foie de patient atteint d’un CHC (Gripon et al., 2002). Ces cellules sont similaires à des cellules ovales du foie et constituent la première lignée de cellules progénitrices du foie décrite dans la littérature (Parent et al., 2004). En effet, les cellules HepaRG sont capables de se différencier au cours du temps pour donner deux phénotypes cellulaires distincts après ajout de diméthylsulfoxide (DSMO) : des cellules de type hépatocytaire et des cellules de type biliaire (Figure 47).

Figure 47 : Différenciation des cellules HepaRG au cours du temps

Les cellules différenciées montrent des propriétés similaires à celle du foie en exprimant la plupart des marqueurs spécifiques et notamment les enzymes du métabolisme des drogues et tous les transporteurs membranaires habituellement retrouvés dans le foie. Les cellules HepaRG

jours 30 15 1 1,8 % DMSO Cellules de type hépatocyte Cellules de type biliaire

représentent donc une excellente alternative aux hépatocytes primaires humains pour étudier le métabolisme du foie (Guillouzo et al., 2007, Kanebratt & Andersson, 2008).

Par ailleurs, il a été montré récemment dans notre laboratoire que, contrairement aux lignées d’hépatomes HuH7 et HepG2 (Keskinen et al., 1999), une stimulation au polyIC est capable d’induire un état antiviral dans les cellules HepaRG. Les données montrent, de plus, que les voies de signalisation Jak/Stat, RIG et TLR3 sont fonctionnelles dans ces cellules (Maire et al., 2008). Les