Chapitre I : Devenir du carbone en conditions de croissance à partir de xylose et glycérol en
1. Etude prédictive des flux de carbone intracellulaires par modélisation métabolique
1.2. Modélisation du métabolisme de croissance via les flux de carbone intracellulaires
La modélisation des flux de carbone intracellulaires vise à étudier de manière stœchiométrique le métabolisme de Rhodotorula glutinis en condition de croissance. L’objectif de cette partie du travail est de quantifier la demande en carbone nécessaire pour satisfaire les besoins anaboliques, cataboliques, énergétiques et en pouvoir réducteur nécessaires à la stœchiométrie de croissance de la souche. Ces calculs sont réalisés avec un descripteur métabolique prenant en compte soixante-quatre réactions et développé au sein de l’équipe FAME tel que décrit dans le chapitre Matériel et Méthodes (Cf. paragraphe Le descripteur
substrats avec le glucose.
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métabolique page 107). La résolution se fait sous l’application de contraintes, dans un modèle simplifié ne prenant pas en compte la compartimentation cellulaire.
La première contrainte est le rendement de conversion du carbone en biomasse, issu des travaux de J. Cescut et égal à 0,49g.g-1 de glucose soit 0.64Cmol.Cmol-1 (Cescut J., 2009). La seconde contrainte est la synthèse de cofacteurs considérée comme un point clé dans l’assimilation et le catabolisme des substrats carbonés étudiés. Celle-ci permet d’envisager plusieurs scénarii. Ainsi, en fonction de l’importance relative des réactions génératrices de NADPH, H+, les simulations permettent l’obtention de cartes détaillées sur la Figure 25 où :
- le schéma a) correspond à un flux de carbone minimum dirigé vers la voie des pentoses phosphates satisfaisant la demande anabolique en phospho-ribosyl-pyrophosphate (PRPP) et erythose-phosphate ; dans ce cas le rendement énergétique YATP calculé est de 14,82 ; la fraction du flux d’
-D-glucose-6-phosphate allant vers le cycle des pentoses-phosphate ramené au flux net catabolisé est estimée à 13%.- le schéma b) correspond à une activité de l’enzyme malique, qui est le déterminant principal, minimale avec une valeur du rendement énergétique YATP de 12.77. La fraction du flux d’
-D-glucose-6-phosphate allant vers le cycle des pentoses-phosphate ramené au flux net catabolisé est estimée alors à 71%.- le schéma c) correspond à une fraction du flux d’
-D-glucose-6-phosphate allant vers le cycle des pentoses-phosphate ramené au flux net catabolisé de 33%. Selon la littérature, c’est la valeur admise pour S. cerevisiae, Cette simulation correspond à un rendement énergétique de 14.04.120 b)
substrats avec le glucose.
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Figure 25 : Flux métaboliques de Rhodotorula glutinis.
a) Réseau résolu sous la contrainte d’un flux minimal dirigé vers la voie des pentoses phosphate, YATP = 14,82. b) Réseau résolu sous les contraintes suivantes : 33% du flux dirigé vers la voie des pentoses, YATP = 14.04.c) Réseau résolu sous les contraintes suivantes : flux minimal dirigé vers la voie de l’enzyme malique, YATP = 12.77.
Quelles que soient les valeurs réelles des flux intracellulaires de carbone il apparaît que les demandes anaboliques restent inchangées dans les trois simulations décrites ci-dessus. Plusieurs scénarii d’estimation des besoins en glucose et en glycérol (exprimés en pourcentage du carbone apporté par le glycérol rapporté au carbone total consommé), sont envisagés. Une hypothèse est que le glycérol se substitue progressivement aux demandes carbonées anaboliques de la voie glycolytique à partir du glycéraldéhyde-3-phosphate, aux flux catalytiques du cycle des acides tricarboxyliques, avant d’amorcer une flux net néoglucogénique pour alimenter le cycle des pentoses-phosphate, ce dernier participant partiellement à la production de NADPH,H+, avant de satisfaire totalement les besoins anaboliques issus de ce cycle. Ces ratios graduels (Cglycérol/Ctotal) sont reportés dans le Tableau 44.
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Tableau 44 : Scénarios métaboliques envisagés de co-consommation du glucose et de glycérol.
PGA : phosphoglycérate, PEP : phosphoénolpyruvate, OAA : Oxaloacétate, aKg α-cétoglutarate.
Glycérol hypothèse (a) hypothèse (b) hypothèse (c) demande anabolique en glycerol-phosphate + PGA + PEP 8%
demande anabolique en glycerol-phosphate + PGA + PEP + pyruvate
16% demande anabolique en glycerol-phosphate + PGA + PEP + pyruvate + Acétyl-CoA
34% demande anabolique en glycerol-phosphate + PGA + PEP + pyruvate + Acétyl-CoA + OAA + aKG + Succinyl-CoA
53%
demande pour glycolyse à partir des trioses-phosphate + TCA 76% 68% 73% demande pour glycolyse à partir de triose P+ TCA +Voie
pentose P+ pentose P + erythrose P
86% 86% 86%
Glycérol hypothèse (a) hypothèse (b) hypothèse (c)
De même, pour le xylose, il est possible d’envisager des scenarii dans l’hypothèse où la consommation satisfait en premier lieu les demandes anaboliques, puis les flux glycolytiques avant la réaction catalysée par la fructose-1,6-bisphosphatase, phase terminale de la voie gluconéogénique générant le NADPH,H+ et finalement le glucose-phosphate. Dans cette logique, les ratios graduels (Cxylose/Ctotal) sont reportés dans le Tableau 45.
Tableau 45 : Scénarios métaboliques envisagés de co-consommation du glucose et du xylose.
PGA : phosphoglycérate, PEP : phosphoénolpyruvate, OAA : Oxaloacétate, aKg α-cétoglutarate
Xylose Hypothèse (a) Hypothèse (b) Hypothèse (c) demande en pentose-phosphate 5%
demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate 7% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + Glycérol-phosphate
8% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + Glycérol -phosphate + PGA
12% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + Glycérol -phosphate + PGA + PEP
15% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + Glycérol -phosphate + PGA + PEP + pyruvate
23% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + Glycérol -phosphate + PGA + PEP + pyruvate + Acétyl-CoA
41% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + GlyP + PGA + PEP + pyruvate + Acétyl-CoA
53% demande en pentose-phosphate + erythrose-phosphate + Gly-phosphate + PGA + PEP + pyruvate + Acétyl-CoA + OAA + aKg + Succinyl-CoA +TCA
78% 73% 77%
Conclusion.
Afin de progresser dans l’exploration et la compréhension des phénomènes métaboliques de la consommation du xylose ou du glycérol purs ou en mélanges avec du glucose, un modéle métabolique a été utilisé de manière prédictive. A partir d’hypothèses sur
substrats avec le glucose.
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le rendement carbone et sur l’importance relative des voies métaboliques génératrices de NADPH,H+ dans l’approvisionnement en cofacteurs, la simulation a permis de calculer des stratégies d’alimentation en co-substrats de manière à satisfaire théoriquement les besoins de la souche, et à identifier de potentiels points métaboliques clés. Ainsi, le co-substrat pourrait être progressivement alimenté par ratios successifs selon des ratios Ccosubstrat/Ctotal proches de ceux mis en évidence par l’étude prédictive, avant d’être apporté comme seul substrat carboné. Cette approche argumente de la nécessité de développer une stratégie expérimentale de culture permettant le contrôle des flux et concentrations en sources carbonées pour la quantification et la caractérisation du comportement dynamique métabolique de R. glutinis sur des substrats simples xylose et glycérol et co-substrats glucose-xylose et glucose-glycérol. Des cultures en mode fed-batch sont donc réalisées et les résultats présentés ci-après.
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