A partir de glucose et de glycérol en simple ou co-substrats

Les dynamiques d’accumulation lipidique de Rhodotorula glutinis à partir de de glucose et de glycérol ont été étudiées selon la même démarche d’apport en ratios progressifs et quantifiées lors de cultures en mode fed-batch. La Figure 37 représente l’évolution des paramètres biologiques lors d’une culture de Rhodotorula glutinis. Les phases expérimentales sont les suivantes : une phase de croissance pure, d’abord avec le glucose comme substrat, puis, lorsque la biomasse atteint 6gcdw.L^-1, à partir de 5 heures de culture, avec le glycérol en co-substrat avec le glucose selon un ratio à 6%. La stabilisation du QR à une valeur de 1.1 sur ce ratio à 6% entre 10h et 16h de culture indique la stabilisation du métabolisme (Figure 38). La limitation en azote est alors appliquée à 16h (ce qui est représenté par des pointillés rouges sur la Figure 37) alors que le ratio carbone de 6% est maintenu. La concentration en biomasse est alors de l’ordre de 15gcdw.L-1. En plus de ce premier pallier d’apport en co-substrats, trois ratios intermédiaires (27, 57%, et 78%) sont expérimentés au cours de la fermentation avant que seule l’alimentation de glycérol ne soit maintenue (ratio 100%), après 60 heures de culture. Le ratio N/C apporté évolue au cours de la culture selon un profil exponentiel décroissant en fonction de la capacité de la souche à accumuler des lipides et à consommer les substrats carbonés. En fin de culture il est autour de 0.05 molN.molC^-1. La concentration en biomasse totale a pour valeur finale 75 gcdw.L^-1.

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Figure 37 : Evolution de la concentration en biomasse, du ratio azote sur carbone et du ratio de l’apport en substrats carboné lors d’une culture de Rhodotorula glutinis, mode fed-batch, 30°C, pH 5.6, milieu

salin, substrats glucose et glycérol, limitation azote.

L’évolution du coefficient respiratoire, indicateur en ligne de la synthèse lipidique, et du KLa sont représentées sur la Figure 38 ; comme mentionné dans le chapitre 1 (Section 1.2 des résultats de la publication, page 133), du fait du caractère plus réduit du glycérol par rapport au glucose, la métabolisation du glycérol entraîne une diminution du QR.

azote par la levure Rhodotorula glutinis.

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Figure 38 : Evolution du KLa, du coefficient respiratoire et du ratio en substrats lors d’une culture de

Rhodotorula glutinis, mode fed-batch, 30°C, pH 5.6, milieu salin, substrats glucose et glycérol, limitation

azote.

Il apparaît, lors de la phase de croissance, que le coefficient respiratoire se stabilise autour de 1.08. Cette stabilisation du métabolisme, indiquant une co-consommation de par la valeur du coefficient respiratoire (pour rappel, le QR était de 1.15 dans l’expérience précédente sur glucose pur avant la mise en place de la limitation) a encouragé la mise en place de la limitation par l’azote (indiquée par des pointillés rouges sur la figure 38). En réponse à la limitation, on observe une augmentation du QR, ce qui traduit la mise en place de la synthèse lipidique. L’augmentation du QR se poursuit lorsque le ratio suivant (27%) est mis en place. Par contre, de manière très nette, le coefficient respiratoire diminue dès lors que l’apport en glycérol augmente : à 20h, 42h et 60h de culture, ce qui correspond respectivement à la mise en place des ratios 57%, 78% et 100%. Les variations de ce signal confortent la (co)-consommation des substrats carbonés. Le coefficient respiratoire stabilisé sur glycérol pur est ici de 0.9. Dans le chapitre 1, le coefficient respiratoire observé sur glycérol pur en condition de croissance était de 0.8. Cette comparaison confirme le maintien du métabolisme d’accumulation puisque le QR est plus élevé qu’en condition de croissance, mais plus faible que celui observé sur les paliers précédents ou sur glucose pur.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Coe ff ici en t re sp irat o ire (/) Rat io en sub stra ts carb o n és (C m o l x^ylo se / C^m o l t^o ta l ) K^L a (h -1) Temps (h)

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Il est intéressant de souligner que dans la perspective d’un suivi en ligne du procédé d’accumulation de lipides, le coefficient respiratoire est un bon indicateur lorsque les substrats carbonés utilisés sont le xylose et/ou le glucose. Cependant la consommation du glycérol entraine un abaissement du QR, à l’inverse du phénomène d’accumulation de lipides qui induit une augmentation. Ce signal est donc inadapté pour le suivi en ligne de l’accumulation lipidique à partir du substrat glycérol.

La Figure 39 représente les pourcentages massiques en lipides totaux et polysaccharides totaux analysés lors de la culture. Initialement mesurée à 13.5% de la masse sèche totale, la teneur en lipide augmente et semble se stabiliser autour de 35-40% de la biomasse totale. Il est par contre difficile d’évoquer une évolution du pool polysaccharidique : tout au long de l’expérimentation la teneur semble stabilisée entre 8 et 10% de la masse sèche totale.

azote par la levure Rhodotorula glutinis.

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Figure 39 : Evolution des pools macromoléculaires a) lipides intracellulaires totaux b) polysaccharides totaux, lors d’une culture de Rhodotorula glutinis, mode fed-batch, 30°C, pH 5.6, milieu salin, substrats

glucose et glycérol, limitation azote.

Ces résultats montrent que le métabolisme de synthèse et d’accumulation lipidique est mis en place sous le fait de la limitation nutritionnelle par l’azote, alors que glucose et glycérol sont co-consommés. Toutefois, l’évolution des pools macromoléculaire, révélant en particulier une stabilisation assez rapide de la teneur en lipides (Figure 39), ne corrèle pas au N/C apporté

a)

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(Figure 37) qui lui diminue continuellement. Une réconciliation des données concernant les compositions élémentaires et macromoléculaire est nécessaire.

1.2.Problématique de la composition de la biomasse catalytique et réconciliation