Modélisation des enzymes de branchement d’A thaliana

Afin de déterminer si les enzymes de branchement BE2.2 et BE2.1 présentent des spécificités dans leur organisation structurale, nous avons calculé des modèles moléculaires pour ces enzymes sur la base de leur séquence primaire par le logiciel SWISS-MODEL. Ce programme génère un modèle sur la base d’homologie de séquence à partir d’informations de structures connues et répertoriées dans la base de données PDB (Protein Data Bank).

Pour BE2.2 comme BE2.1, c’est l’enzyme de branchement de type I d’Oriza sativa (riz) qui présente le plus d’identité de séquence (60% avec BE2.2 contre 59% pour BE2.1).

La BEI mature (dépourvue de son peptide de transit), d’une taille de 755 acides aminés, possède un domaine N-terminal plus court que BE2.2 et BE2.1 ; en revanche, son domaine C-terminal est plus long (Annexe 6).

En conséquence, le programme SWISS-MODEL a modélisé BE2.2 du résidu 125 à 805 et BE2.1 a été modélisée du résidu 160 à 830 (selon la numérotation des protéines non matures).

Outre la taille des extrémités N- et C-terminales, la comparaison des séquences protéiques de BE2.2 et BE2.1 met en lumière trois différences entre les deux enzymes qui sont également retrouvées dans les modèles générés par SWISS-MODEL.

Ces différences (nommées site A, B et C) ont été reportées en Figure 28 et en Annexe 5 :

- Site A : Une boucle, reliant deux brins β du CBM48, est plus courte pour

BE2.2 que pour BE2.1 (Figure 28A)

- Site B : inclus dans la boucle (β3α3) et localisé entre les régions

conservées I et II du domaine catalytique ne s’oriente pas de la même façon pour les deux enzymes (Figure 28B)

- Site C : Une boucle localisée en aval de la région IV du domaine

catalytique s’oriente vers la molécule pour BE2.1 et vers l’extérieur pour BE2.2 (Figure 28C)

Figure 28 : Comparaison des modèles moléculaires de BE2.2 et BE2.1. Modèle moléculaire de BE2.2

en cian et BE2.1 en marron. Les différences entre les modèles sites A, B et C sont repérées par un cercle noir. En rose, vert et bleu sont indiquées les positions du CBM48, du domaine catalytique et du domaine C-terminal respectivement.

Au sein des membres de la famille GH13_8 et 9, le domaine catalytique et le CBM48 sont très conservés. Si ces différences de structure mises en lumière par les modèles sont avérées, il est donc fort probable qu’elles soient reliées à une fonction précise dans la catalyse ou à des interactions avec les partenaires protéiques. Afin de déterminer si les modèles obtenus pour BE2.2 et BE2.1 reflètent la structure des protéines en solution, nous avons donc cherché à déterminer si ces sites avaient déjà été décrits dans la littérature.

-Le site B inclut des résidus qui ont été décrits par Chaen et collaborateurs comme intervenant

dans des interactions (décrit section 2.4.5.2 de l’introduction bibliographique). Les résidus 294_{HE de la}

BEI du riz, impliqués dans l’interaction avec le maltoheptaose, sont localisés dans la région définie comme le site B chez les BEs d’A. thaliana (Annexe 6). Dans cet article, les auteurs émettent

l’hypothèse que 3 sites d’interactions puissent être responsables d’un changement conformationnel de l’enzyme en présence de substrat (Chaen, Noguchi et al. 2012).

-Le site C est inclus dans un domaine de 139 acides aminés chez la BEIIb du maïs, (domaine décrit comme faisant partie intégrante du domaine C-terminal présenté dans la section 2.4.5.3 de

l’introduction bibliographique) et localisé en aval de la région IV (en violet, Annexe 7). Ces 139 acides

aminés ont été attribués à un domaine déterminant la sélectivité de substrat (Kuriki, Stewart et al. 1997). De manière intéressante, chez la BEI du riz, ce site C se caractérise par une boucle plus courte que ce qui est observé chez les BEs de type II d’Arabidopsis. En revanche, ce site C chez les BEs d’Arabidopsis est très similaire à celui retrouvé chez la BEIIa et b du maïs .

-A ce jour, aucune corrélation du site A avec un rôle connu n’a été déterminée

A l’heure actuelle, seule la structure de la BE bactérienne de Cyanothece (Hayashi, Suzuki et al. 2017) a été résolue en complexe avec un sucre dans son site actif. Cette enzyme est classée parmi les BEs de type I et bien qu’elle possède moins de 30% d’identité de séquence avec les enzymes de branchement d’A. thaliana, cette enzyme est, avec celle de Mycobacterium Tuberculosis, une des seules dont la structure a été résolue dans son intégralité par cristallographie aux rayons X.

Les modèles obtenus pour les BEs d’A. thaliana ont été comparés avec la structure de l’enzyme bactérienne de Cyanothece (Figure 29) pour mettre en évidence d’éventuelles modifications conformationnelles pouvant être à l’origine de différences de leur paramètres enzymatiques respectifs.

Figure 29 : Comparaison de la structure de Cyanothece avec les modèles moléculaires de BE2.2 et BE2.1. Superposition de la structure de l’enzyme de branchement de Cyanothece sp.(ATCC

51142, LF-WtBE1 : PDB code 5GQUX en vert) en complexe avec du maltoheptaose dans son site catalytique (la triade catalytique est indiquée en rose) avec le modèle moléculaire de BE2.2 à gauche (marron, sa triade catalytique est indiquée en bleu) et avec le modèle moléculaire de BE2.1 à droite (jaune), les sites B et C sont encerclés en noir et représentés en couleurs (rouge et rose pour BE2.2 et BE2.1 respectivement).

Pour BE2.2 comme BE2.1, les modèles obtenus corrèlent avec le mécanisme décrit chez l’enzyme bactérienne, à savoir la possibilité d’insérer 6 glucoses au niveau du site actif. Dans le cas de BE2.2, la boucle incluant le site C est en contact avec le substrat dans le sillon catalytique avec à l’opposé de ce sillon la boucle β3α3. (incluant le site B) (à gauche Figure 29). L’orientation de la boucle incluant le site C chez BE2.1, vers l’extérieur de la protéine, suggère un sillon catalytique plus grand (à droite Figure 29).

Les résultats obtenus grâce aux analyses bio-informatiques sont cohérents avec ce qui est connu dans la littérature et mettent en lumière des différences entre les BEs de type I et II. A ce jour, aucune donnée structurale n’est disponible sur les BEs de type II. Afin d’évaluer l’organisation structurale des BEs d’A. thaliana et notamment au niveau du domaine N-terminal, nous avons entrepris une étude structurale par SAXS. Les données structurales acquises sur les enzymes de branchement d’Arabidopsis seront ensuite mises en parallèle avec la caractérisation enzymatique de BE2.2, BE2.1 et de GlgB d’E. coli.