Modèles d’études des P450s

Les différents modèles d’études des fonctions hépatiques sont représentés dans le tableau VII. Il existe de nombreux systèmes d’études, chacun ayant une utilité spécifique dans un domaine particulier. Classiquement, la technique du foie isolé perfusé, les tranches de foie, les hépatocytes isolés et en culture sont employés en développement préclinique, les microsomes servent au screening avant les études chez l’animal.

L’Homme est le meilleur modèle d’étude. Cependant, les modèles humains in vitro pour évaluer l’hépatotoxicité sont peu utilisés en industrie pharmaceutique. En effet, les données littéraires sont peu fournies et leur utilisation entraîne des difficultés techniques, du fait de leur variabilité et de leur manque de disponibilité [34]. Les morceaux de foie humain sont en effet difficiles à obtenir, puisque les foies sont en priorité réservés pour les transplantations hépatiques. L’industrie pharmaceutique et la recherche peut toutefois obtenir des morceaux de foie sains prélevés lors d’une biopsie d’un foie malade lors de cancer par exemple, puisqu’une partie non touchée du foie est systématiquement enlevée pour éliminer au maximum les cellules tumorales. De plus, l’utilisation de foie humain pose des problèmes éthiques. Le Comité d’éthique doit donner son accord au préalable, valable uniquement pour un projet bien déterminé.

Les modèles obtenus à partir de rongeurs, en particulier les rats, sont beaucoup plus disponibles. Les rats peuvent être traités par des injections de dexaméthasone avant leur sacrifice. Ce corticoïde entraîne une surexpression des cytochromes de la famille 3A, famille la plus présente dans le foie humain. L’extrapolation des données obtenues à l’Homme est alors facilitée. Des injections de phénobarbital, de la famille des barbituriques, ou de 3- méthylcholanthrène, hydrocarbure aromatique polycyclique carcinogène, induisant les cytochromes de la famille 2 et 1 respectivement, peuvent également être réalisées [26].

Les modèles hépatiques que nous avons utilisés sont les microsomes de rat et humains, les coupes de foie de rat et humain, les hépatocytes de rat en culture primaire (hépatocytes commercialisés congelés) et les hépatocytes isolés à partir du foie de rat puis mis en culture primaire.

Les applications des modèles hépatiques in vitro dans les études de pharmacotoxicologie sont diverses et comprennent l’étude des paramètres cinétiques (Km, Vmax…), du profil métabolique des xénobiotiques, des comparaisons inter-espèces, des inductions et inhibitions enzymatiques par action des P450s et des enzymes de phase II, des P450s impliqués dans la métabolisation de divers composés, des interactions médicamenteuses, de l’influence du polymorphisme génétique, de cytotoxicité et génotoxicité… [53]

D’un point de vue réglementaire, les recommandations proposées en vue de l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (AMM) se sont considérablement développées au cours de ces dix dernières années. Il y a une dizaine d’année, il suffisait pour le laboratoire pharmaceutique de démontrer que le composé était métabolisé ou non (grâce aux techniques du foie isolé perfusé et des coupes de foie). Au fur et à mesure des années, d’autres informations ont dû être apportées dans chaque dossier d’AMM, afin de garantir une meilleure efficacité et une meilleure sécurité au médicament mis sur le marché. Ainsi, le ou les métabolites sont identifiés et leurs éventuelles activités thérapeutiques, toxicités, réactivités vis-à-vis des macromolécules sont déterminées. Ensuite, le lieu où se passe le métabolisme, le ou les organes impliqués, sont mentionnés (grâce à l’utilisation de l’organisme entier). Les systèmes enzymatiques impliqués sont indiqués (avec l’utilisation d’hépatocytes ou de microsomes), en vue de prévoir les interactions possibles avec les voies métaboliques de produits endogènes, exogènes (interactions médicamenteuses) ou de nutriments. Dans ce même but et pour étudier le polymorphisme génétique, les isoformes impliquées sont également citées (à la suite d’études sur enzymes purifiées ou avec des inhibiteurs). Ainsi, un médicament substrat du CYP3A ou du CYP2D6 a toutes les chances

d’être rejeté dès le début du développement. En effet, environ 60% des médicaments sur le marché sont métabolisés par le CYP3A, ce qui augmente le risque d’interactions médicamenteuses. En ce qui concerne le CYP2D6, il est soumis à un important polymorphisme génétique, un médicament métabolisé par cette isoforme ne pourra donc pas être utilisé de la même façon dans toutes les populations.

Modèle Avantages Limites

Fonctions proches de celles de l'organe in vivo Viabilité : 2-3 heures

Equipement enzymatique préservé Etude d'un faible nombre de composés Structure lobulaire conservée Diminution de l'excrétion biliaire après 1 à 3 Canalicules biliaires fonctionnels heures

Collecte de la bile possible Pas d'études sur le foie humain Etudes cinétiques court terme Approprié pour de petits animaux Foie isolé

perfusé

Pas de réduction du nombre d'animaux utilisés

Structure lobulaire conservée Viabilité : 6 heures à 2 jours Equipement enzymatique préservé Collecte de bile impossible

Etudes possibles sur foie humain Toutes les cellules ne sont pas conservées de Etudes de plusieurs composés à différentes la même façon (variabilité inter-étude) Coupes de foie

concentrations Obtenus à partir de foies entiers ou de

biopsies Viabilité : 2-4 heures en suspension

Fonctions proches de celles des hépatocytes Pas de canalicules biliaires

in vivo

Etudes de plusieurs composés à différentes

concentrations

Etudes inter-espèces

Représentatifs de différentes sous-populations

lobulaires

Hépatocytes isolés

Cryoconservation Fonctions exprimées pendant plusieurs jours Changements phénotypiques précoces dans certaines conditions Canalicules biliaires altérés

Induction/inhibition des enzymes de

métabolisation Cultures

primaires d'hépatocytes

Etudes inter-espèces

Nombre de cellules illimité Activités enzymatiques perdues ou _diminuées Lignées

d'hépatocytes

Quelques fonctions conservées Instabilité génotypique Activités enzymatiques préservées Etudes court terme

Production de métabolites Pas de réactions d'enzyme de phase II

cytosoliques

Nécessité de cofacteurs pour les mesures

d'activité Microsomes

Mélange d’isoformes

Activités enzymatiques préservées Pas de vue d’ensemble de la métabolisation Etudes inter-espèces

Enzymes purifiées

P450

recombinants Etudes des différentes isoformes séparément

Tableau VII : Avantages et limites des modèles hépatiques in vitro (D’après A. Guillouzo, 1998 [53])