3.1 Métabolisme des caroténoïdes
3.1.4 Les modèles "in vivo"et " in vitro"
3.1.4.3 Le modèle " in vitro" cellulaire de type Caco-2
Les modèles cellulaires de type Caco-2 sont couramment utilisés en couplage avec les modèles de digestion in vitro pour évaluer l’absorption ou le transport des caroténoïdes. La lignée cellulaire Caco-2 est issue d’un adénocarcinome humain. Cette lignée cancéreuse colique à la particularité de se différencier, dans des conditions de culture normale, en monocouche cellulaire ressemblant à un épithélium intestinal. Après 20 jours de culture, les cellules se différencient et se polarisent, 10 jours plus tard, elles deviennent cylindriques avec une bordure en brosse au pôle apical formée de microvillosités organisées en plateau strié (Pinto et al., 1983). Ces cellules expriment des activités de type hydrolase caractéristique des entérocytes incluant le complexe sucrase-isomaltase, les lactases, aminopeptidases ou la phosphatase alcaline (Hauri et al., 1985 ; Rousset et al., 1985). De plus, une série de transporteurs a été mise en évidence dans les cellules Caco-2 tels que les transporteurs de glucose (SGLT-1, GLUT-1, GLUT-2, GLUT-3, GLUT-5), d’acides aminés (PepT1), de lipides (SR-B1, NPC1L1) ou encore les transporteurs ABC. Ces transporteurs ABC regroupés sous le terme de "Multidrug Resistance Protein" permettent l’efflux hors des cellules ou le transport intracellulaire de toute une diversité de composés incluant les lipides, protéines, sucres et les xénobiotiques (Baron-Delage et al., 1996 ; Gutmann et al., 1999 ; Behrens et al., 2004 ; Peretti et al., 2007 ; Duval et al., 2006).
Comme cela a été dit précédemment, le transport des caroténoïdes peut être facilité par l’implication de transporteurs. Reboul et al., (2005b) ont montré que le transporteur SR-B1 permettait, en partie, l’absorption de la lutéine par les cellules Caco-2 (clone TC7). La protéine intestinale SR-B1 est impliquée dans le transport des lipides plus particulièrement du cholestérol de même que NPC1L1 ou encore ABCA1 (Werder et al., 2001 ; Altmann et al., 2004). Ces transporteurs sont donc des candidats potentiels pour le transport des micronutriments lipophiles comme les caroténoïdes. A ce sujet, During et al. (2005) ont montré une diminution de la vitesse d’absorption des caroténoïdes parallèlement à la baisse du niveau des ARN messagers des transporteurs (SR-B1, NPC1L1, ABCA1). Les auteurs
suggèrent que ces trois transporteurs de cholestérol jouent un rôle dans le transport intestinal des caroténoïdes.
Les cellules Caco-2 sont également capables d’assembler et de sécréter des chylomicrons à condition de les supplémenter en acide oléique et taurocholate (Luchoomum & Hussain, 1999). De plus, la présence de l’enzyme de clivage du β-carotène dans deux clones (PF11 et TC7) de la lignée parentale permet d’étudier la bioconversion des caroténoïdes provitaminiques en vitamine A (During & Harrison, 2004). L’activité de cette enzyme est stimulée par les sels de fer et inhibée en présence de chélateurs de fer (During et al., 2001).
L’absorption entérocytaire des caroténoïdes par les Caco-2 semble varier suivant le type de caroténoïde. Le β-carotène serait le mieux absorbé, suivi de la lutéine et du lycopène (During et al., 2002 ; Garrett et al., 1999b ; Sugawara et al., 2001). La sélectivité observée entre ces différentes molécules suggère l’existence de mécanismes de captage spécifiques au niveau de l’entérocyte. Le captage préférentiel du β-carotène par rapport à la lutéine a été observé dans des études couplant la digestion in vitro aux cellules Caco-2 (Garrett et al., 2000 ; Liu et al., 2004). Borel et al., (1996) suggèrent que la forme émulsifiée du β-carotène est plus stable, comparativement à un composé plus polaire, et donc plus facilement captée par la bordure en brosse de l’entérocyte. Garrett et al. (1999b) propose plutôt une interaction entre caroténoïdes. L’absorption des isomères cis du β-carotène a été également étudiée sur cellules Caco-2 mais les résultats sont divergents. During et al. (2002) ont montré que l’absorption du trans- β-carotène était environ 5 fois supérieure à celles des isomères 9- et
13-cis. Par contre, Ferruzzi et al., (2006) indiquent que si l’isomère cis du β-carotène est
généralement mieux micellarisé que la forme trans, son absorption au niveau des cellules Caco-2 serait similaire à la forme trans. Ces différences sont probablement dues aux types de micelle utilisés. Dans un cas les micelles artificielles sont préparées avec du Tween 20, qui est un détergent, dans l’autre les micelles physiologiques issues de la digestion in vitro requièrent la présence de sels biliaires.
Une seule étude donne une estimation de l’absorption des esters de xanthophylles par les cellules Caco-2. D’après Chitchumroonchokchai et al. (2006), les monoesters de zéaxanthine sont captés par les cellules Caco-2 mais cependant moins que la forme libre, laquelle est prédominante. Ces monoesters représentent 6 % de la quantité initiale du milieu. Cependant, suivant le type de micelle, qu’elles proviennent de digestion in vitro (micelles physiologiques)
ou de composés purs (micelles synthétiques), les quantités de caroténoïdes absorbées peuvent être différentes (Chitchumroonchokchai et al., 2004). Ces différences sont certainement dues à la structure ou à la composition des micelles. La composition de la micelle peut également influencer l’absorption du caroténoïde par la cellule. Les micelles contenant de la lyso-phosphatidylcholine augmentent l’absorption du β-carotène et de la lutéine comparativement avec celle des micelles contenant de la phosphatidylcholine (Sugawara et al., 2001).
Le transfert des caroténoïdes du pôle apical au pôle basolatéral caractérise le mécanisme de sécrétion et de transport des caroténoïdes. Après être absorbés dans l’entérocyte, les caroténoïdes sont incorporés dans les chylomicrons. Cette incorporation dépend de la spécificité des caroténoïdes dont l’ordre est le suivant β-carotène > xanthophylle > lycopène (During et al., 2002). Chitchumroonchokchai et al. (2004) ont montré qu’après absorption de lutéine par les cellules Caco-2, 7 % de la lutéine retrouvée dans le compartiment basolatéral était sécrété dans les chylomicrons dont la fraction lipoprotéique riche en triacylglycérol contenait 98 % de la lutéine. Les mêmes auteurs ont étudié l’absorption par les Caco-2 d’un mélange de zéaxanthine libre et estérifiée ; ils ont montré que seule la forme libre est détectée dans le pôle basolatéral et que 4 % sont transférés dans la fraction riche en triacylglycérol (Chitchumroonchokchai et Failla, 2006). Les auteurs suggèrent que les Caco-2 ne sont pas capable d’hydrolyser les esters de zéaxanthine. Dans cette étude, la faible quantité de zéaxanthine transférée dans les chylomicrons est en accord avec l’estimation de l’absorption de 3,3 % pour 5 mg de zéaxanthine administrés à des sujets humains (Breithaupt et al., 2004). De plus, les cellules Caco-2 sont également capables de synthétiser des esters de rétinol (Nayak et al., 2001). Cet auteur a montré que la sécrétion d’esters de rétinol par les cellules est spécifiquement régulée par l’assemblage des chylomicrons dans des conditions post-prandiales. Après incorporation de rétinol radioactif à des micelles synthétiques contenant de l’acide oléique et du taurocholate, la présence d’esters de rétinol a été confirmée dans la fraction riche en triacylglycérol du milieu basolatéral (Chitchumroonchokchai et al., 2004). D’autres études in vitro seraient nécessaires pour compléter l’estimation de la biodisponibilité des caroténoïdes provitaminiques chez l’homme car de nombreux mécanismes sont encore inconnus.
D’une manière générale, les études sur la biodisponibilité des caroténoïdes par des modèles in vitro sont peu nombreuses. De plus, les méthodologies utilisées sont la plupart du temps différentes ce qui rend difficile toute comparaison. Pour exposer les cellules Caco-2 à
des caroténoïdes, 4 types de micelles ont été répertoriés. Les micelles dites synthétiques sont fabriquées à partir de Tween 40, à partir de DMSO (Liu et al., 2004), ou encore à partir d’une composition lipidique (phospholipides, acide gras, cholestérol, taurocholate) ce qui se rapproche le plus des conditions physiologiques. A ce type de micelles se rajoutent les micelles dites physiologiques issus de la digestion in vitro faites à partir de sels biliaires. La structure moléculaire, la taille et le nombre de micelles sont des facteurs qui doivent contribuer aux différences d’absorption des caroténoïdes rapportées dans différentes études.
Les modèles in vitro acellulaires ont permis d’expliquer les mécanismes régulant la micellarisation des caroténoïdes suivant différents facteurs. Ces modèles ont pu être complétés par des modèles cellulaires pour comprendre les phénomènes d’absorption et de transport des caroténoïdes au niveau de l’entérocyte. Cependant, d’autres données concernant l’absorption et le transport seraient nécessaires pour approfondir les connaissances dans ce domaine. Bien que les modèles in vitro soient limités, car ils ne tiennent pas compte de la dynamique observée in vivo, ils restent indispensables pour élucider certaines étapes du métabolisme humain.