Dans ce modèle, les cellules sont isolées et générées à partir de poche de sang.
1.1. Préparation des cellules
Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir de concentrés leucocytaires de donneurs anonymes séronégatifs pour le VIH-1 et le virus de l’Hépatite C (VHC) provenant de l’Etablissement Français du Sang (EFS).
Les monocytes sont isolés par le biais d’une sélection positive en utilisant des billes magnétiques CD14+ (autoMacs Pro Separator, Miltenyi), puis différenciés en monocytes dérivés en cellules dendritiques (MoDC) dans une solution contenant du milieu RPMI 1640 plus GlutaMAX (GIBCO) supplémenté avec 5% sérum de veau fœtal (SVF), de 10ng/ml granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) et 20ng/ml d’IL-4 (R&D Systems) pendant 6 jours. Les LT CD4 autologues sont purifiés par sélection positive en utilisant des billes magnétiques CD4+ après la purification des cellules CD14+. Les LT CD4 primaires sont activés dans une solution contenant du RPMI 1640 plus GlutaMAX supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et de la phytohémagglutinine-A (PHA) (2µg/ml) (Sigma-Aldrich) pendant 3 jours. Les cellules sont congelées, puis décongelées 1 jour avant leur utilisation dans du milieu RPMI supplémenté avec de l’IL-2.
1.2. Préparation de stock de virus
Le VIH-1 étant un virus hautement pathogène, la manipulation de ce virus nécessite des conditions de sécurité particulière. La production de virus, la concentration de virus, l’infection des cellules primaires par le virus et l’inhibition du virus par des anticorps s’effectuent dans les conditions de confinement d’un laboratoire de type L3.
Amplification du virus
:
Les isolats primaires VIH-1Bal, VIH-1Bx08 ont été fournis par le « National Institute of Health » (NIH; Bethesda, MD). Ces virus de tropisme R5 (sous-type B) utilisent le corécepteur CCR5 pour entrer dans les cellules cibles. Les isolats primaires sont amplifiés in vitro sur un pool de PBMC provenant de trois donneurs séronégatifs différents, préalablement stimulées avec de la PHA et cultivées dans du RPMI supplémenté avec 10% de SVF et de l’IL-2 (Holl et al., 2006b; Moog et al., 1997b). La production de virus est suivie par mesure de l’activité de la transcriptase inverse (RT) dans le surnageant de culture. Celui-ci est prélevé quotidiennement pendant la période de multiplication du virus. Les surnageants contenant le virus sont concentrés à un facteur multiplié par 80 (Centricon 80 Plus Biomax filter, Millipore) avant d’être aliquotés et conservés à -80°C.1.3. Modèle de transmission allogénique
Ce test permet d’analyser les premiers évènements de transmission des LT CD4 du donneur A (LT CD4-A) aux DC et LT CD4 provenant du donneur B (DC-B et LT CD4-B). Ce modèle est développé dans le but de mimer in vitro la transmission du virus des cellules infectées (comme par exemple celles présentes dans le sperme) à des LT CD4 ou des DC (cellules proposées comme étant de possibles cellules cibles du VIH-1 dans les muqueuses) (Figure 15).
Figure 15 : Représentation schématique du modèle de transmission allogénique.
Les LT CD4 du donneur A (LT CD4-A) sont infectés pendant 24h, puis colorés au PKH26 et lavés. Les LT CD4-A sont co-cultivés avec des DC et des LT CD4 d’un donneur B en présence ou en absence d’anticorps. Après 24 et 72h de co-culture, les différentes populations cellulaires sont caractérisées par cytométrie en flux (phénotypage et détection de la protéine virale p24).
+
DC-B VIH-1 primaire R5 (24h d’infection) LT CD4-A (colorés au PKH26) Lavage Anticorps neutralisants (AcN)+/-24h ou 72h de co-culture LT CD4-B Cytométrie en flux
LT CD4-A + VIH-1 + DC-LT CD4-B +/- Anticorps Analyse
Infection et coloration des cellules du donneur A
Les PBMC du donneur A sont déplétées en cellules NK et LT CD8, par sélection positive en utilisant des billes magnétiques CD56+ et CD8+ respectivement, afin d’enrichir la suspension en LT CD4 primaires (autoMacs Pro Separator, Miltenyi). Ces cellules sont ensuite activées pendant 3 jours avec de la PHA. Les LT CD4 activés sont infectés pendant 24h avec les différents isolats primaires à une concentration de 100 à 500ng/ml d’antigène VIH-1 p24, de sorte que le pourcentage de cellules infectées soit supérieur à 2%. Les cellules sont ensuite lavées afin d’éliminer les particules virales non fixées et colorées à l’aide d’un colorant membranaire : le PKH26 (PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma). La coloration des LT CD4 par le PKH26 (fluorescence dans le PE) permet de discriminer les LT CD4 infectés provenant du donneur A des LT CD4 du receveur B (donneur différent). Les LT CD4-A sont resuspendus à une concentration de 12.106 cellules/mL dans du milieu RPMI
Co-culture avec les cellules du receveur B
Les LT CD4 du donneur A sont co-cultivés avec des DC et des LT CD4 du receveur B concentrés à 6.106 cellules/mL et 12.106 cellules/mL respectivement (ratio DC/LT-CDA A/LT-CD4 B = 1/2/2) dans une plaque 96 puits.
Afin d’analyser un cycle unique de réplication, l'inhibiteur de protéase Indinavir (IDV) (AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH) est ajouté à une concentration 1µM dans certaines conditions. L’IDV permet d’inhiber la production de nouveaux virions infectieux. Un inhibiteur de la transcriptase inverse, l’azidothymidine (AZT), est également ajouté dans certaines conditions à une concentration de 5µM (Sigma-Aldrich) pour prévenir toutes nouvelles réplications virales. Afin d’analyser le rôle des anticorps, 25µl d’AcN (10-1074, 3BNC117, PGT121 et 4E10) sont ajoutés à différentes concentrations dans la co-culture en même temps que les cellules infectées. Les anticorps 3BNC117, dirigé contre le site d’attachement au CD4, 10-1074 et PGT121, dirigés contre la boucle variable V3 proviennent du NIH. L’anticorps 4E10, dirigé contre la région MPER de la gp41, provient de Polynum Scientific. L’infection productive est quantifiée après détection intracellulaire de la protéine virale p24 par la technique de cytométrie en flux. Les différentes populations cellulaires sont identifiées par phénotypage après 24 et 72h de culture.