Modèle atomique de Bohr

Houve interação significativa entre os fatores para a variável porcentagem de formação de calos e porcentagem de explantes com antocianina. Já para as variáveis

relacionadas com a regeneração, não houve diferença entre os tratamentos utilizados (Anexos 5 a 9). Contudo, analisando a porcentagem de oxidação, observou-se diferenças estatísticas significativas entre os resultados obtidos nas diferentes concentrações de TDZ.

Os explantes foliares responderam de forma positiva ao TDZ na calogênese, tanto os cortados em água, quanto os cortados em solução antioxidante (Tabela 2). Já no tratamento controle, sem a presença do TDZ, grande parte dos explantes necrosaram, tornando-se pretos, além de não terem formado calos. A combinação de 0,1 µM de ANA com 0,1 µM de TDZ promoveu a calogênese em 100% dos explantes, em ambas as condições de corte, assim como encontrado na combinação de 0,1 µM de ANA com 0,5 µM de TDZ, na presença da solução antioxidante.

Tabela 2 - Calogênese e organogênese em explantes foliares de Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii, cortados em água ou em solução antioxidante*, cultivados in vitro em meio MS contendo 0,1 µM de ANA e quatro concentrações de TDZ, após 42 dias. Média de 2 experimentos.

Porcentagem de explantes necrosados** e oxidados Tratamento TDZ (µM)

0,0 ** 0,1 0,5 1,0 2,0

Água 86,6 aA 0,0 aB 0,0 aB 1,6 aB 1,6 aB

Antioxidante 83,3 aA 0,0 aB 0,0 aB 0,0 aB 3,3 aB

Porcentagem de explantes formando calo Solução TDZ (µM)

0,0 0,1 0,5 1,0 2,0

Água 0,0 aD 100 aA 85 bB 88,3 aB 70 bC

Antioxidante 1,6 aC 100 aA 100 aA 86,6 aB 85 aB

Porcentagem de explantes com antocianina Solução TDZ (µM)

0,0 0,1 0,5 1,0 2,0

Água 0,0 aB 51,6 aA 0,0 aB 0,0 aB 0,0 aB

Antioxidante 0,0 aB 23,3 bA 1,6 aB 1,6 aB 0,0 aB

Porcentagem de explantes regenerando gema Solução TDZ (µM)

0,0 0,1 0,5 1,0 2,0

Água 0,0 aA 0,0 aA 0,0 aA 0,0 aA 0,0 aA

Antioxidante 0,0 aA 1,6 aA 0,0 aA 0,0 aA 1,6 aA

Número médio de gemas por explante regenerando Solução TDZ (µM)

0,0 0,1 0,5 1,0 2,0

Água 0,0 aA 0,0 aA 0,0 aA 0,0 aA 0,0 aA

Antioxidante 0,0 aA 2,0 aA 0,0 aA 0,0 aA 3,0 aA

1_{Valores seguidos de letras minúsculas idênticas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não} diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade de erro. Análises de variância (Anexos 5 a 9). *Ácido ascórbico (250 mg L-1), ácido cítrico (25 mg L-1) e PVP-40 (1g L-1). ** Nos explantes deste tratamento foi observada necrose.

Em relação ao experimento anterior, verificou-se que o TDZ, diferentemente de BAP, além de promover a calogênese, também possibilitou a regeneração de gemas adventícias, embora em baixas taxas. Segundo Mok et al. (1987), de acordo com sua estrutura química, as citocininas são classificadas em dois grupos: as derivadas da adenina (como a 6- benzilaminopurina - BAP) e as derivadas das feniluréias (como o N-phenyl-N'-1,2,3- thidiazol-5-ylurea - Thidiazuron, TDZ). De acordo com Guo et al. (2011), estudos recentes mostraram que o TDZ é frequentemente associado com o metabolismo dos reguladores vegetais. O modo de ação do TDZ pode ser atribuído, dentre outros, a sua habilidade em acumular e translocar auxinas (MURCH e SAXENA, 2001) e, dessa maneira, afetando a organogênese.

A combinação de 0,1 µM de ANA com 0,1 µM de TDZ favoreceu, significativamente, o acúmulo de antocianinas nos explantes (Figura 2A), sendo esse acúmulo maior nos explantes cortados em água. A produção de antocianina pelo tecido pode estar relacionada com a presença de estresse oxidativo. As plantas apresentam um sistema de defesa contra o estresse oxidativo constituído de enzimas antioxidantes, tais como superóxido dismutase e peroxidase, bem como de compostos com atividade antioxidante, podendo-se citar carotenóides, antocianinas e compostos fenólicos. Tanto as enzimas quanto outros compostos metabolizam as espécies reativas de oxigênio (EROs) formadas sob situações de estresse (NOCTOR e FOYER, 1998; SELOTE et al., 2004). Possivelmente, as folhas desse tratamento sofreram estresse devido à ausência do antioxidante no momento do corte, à presença do TDZ, ou devido a alguma alteração quanto à luminosidade, desencadeando a produção de antocianina.

Figura 2 – Aspecto de explantes foliares de E. benthamii x E. dunnii em meio MS contendo 0,1 µM de ANA e 0,1 µM de TDZ. (A) Apresentando antocianina, aos 28 dias de cultivo. (B) Com gemas aos 42 dias de cultivo. Barra: 0,5 cm.

Ainda, segundo Gómez-Zelédon e Jiménez (2011), a produção in vitro de antocianinas pode ser potencializada utilizando elicitores e fatores de estresse. Além disso, estes mesmos

autores relataram que as antocianinas têm sido bastante estudadas, tanto pela sua alta capacidade antioxidante (KONG et al., 2003; PRIOR, 2003; EINBOND et al., 2004), como pela sua capacidade de eliminar radicais livres (WANG et al., 1997; ESPÍN et al., 2000), dentre outros.

Embora a solução antioxidante não tenha reduzido a necrose no tratamento sem TDZ, os explantes cortados nesta solução apresentaram formação de gemas na presença de TDZ (Tabela 2), que pode ter sido influenciada pela solução antioxidante utilizada. Dan (2008) classificou a maioria dos antioxidantes usados na cultura de tecidos de plantas em três grupos com base em suas funções in vitro. O autor relacionou o ácido ascórbico, ácido cítrico e o PVP, utilizados na solução do presente experimento, como um grupo de antioxidantes que podem reduzir o escurecimento dos tecidos e promover a organogênese, embriogênese somática e o crescimento de brotações durante a micropropagação de diferentes espécies de plantas. Além disso, Stasolla e Yeung (1999) observaram que o ácido ascórbico auxiliou de forma positiva a conversão de embriões de Picea glauca, de 47% (controle) para 79% e atribuíram esse fato a um possível efeito desse antioxidante no controle da divisão celular. Com isso, inferimos que os antioxidantes de forma conjunta ou isolada também podem ter proporcionado condições favoráveis para o explante expressar o seu potencial organogênico.

Após 42 dias de cultivo, os explantes que produziram gemas foram transferidos para meio de cultura MS contendo 0,05 µM de ANA e 1,0 µM de BAP. Após 30 dias notou-se oxidação total destes explantes.

De acordo com os resultados obtidos, observa-se que as células do tecido vegetal adquiriram competência organogênica e responderam à presença do TDZ, iniciando a calogênese e a formação de gemas em baixa taxa. Além disso, verificou-se que em 42 dias de cultura as gemas não adquiriram tamanho suficiente para serem separadas do explante inicial.