O Eucalyptus é o segundo gênero florestal mais plantado na região Sul do Brasil, para produção de celulose, papel e energia (AUER e DOS SANTOS, 2011). As geadas são um dos motivos que impedem a expansão da eucaliptocultura na região, sobretudo na fase inicial do desenvolvimento. O híbrido Eucalyptus benthamii x E. dunnii pode ser promissor para plantios em regiões frias e sujeitas a geada. Materiais oriundos da hibridação espontânea entre E. benthamii e E. dunnii estão sendo avaliados pela Embrapa Florestas (Colombo-PR) e vem apresentando superioridade em relação aos progenitores quanto ao crescimento e tolerância a geada (PALUDZYSZYN FILHO et al., 2006).
O melhoramento via transformação genética pode ser uma alternativa para minimizar os impactos negativos causados pelo meio ambiente à expansão da cultura, mediante a inserção de genes de tolerância, como por exemplo, de tolerância à seca, além de características relacionadas com o aumento da produtividade e qualidade da madeira. Ainda, de acordo com Pasquali e Zanettini (2007), a transformação genética pode reduzir o tempo necessário para a introdução de novas características de interesse. Entretanto, para o estabelecimento de um protocolo de transformação é primordial que se tenha estabelecido um eficiente método de organogênese e micropropagação que possibilitem, respectivamente, a regeneração de plantas inteiras a partir das células transformadas e sua posterior clonagem.
A micropropagação, ou propagação vegetativa in vitro, é a aplicação mais utilizada da cultura de tecidos vegetais e consiste na cultura asséptica de células, tecidos, órgãos e de seus componentes, sob condições físicas e químicas definidas in vitro (THORPE, 2007). O sucesso da regeneração in vitro depende do controle da morfogênese, que é influenciada por vários fatores de base genética, pelo tipo de explante, pelos componentes nutricionais, reguladores vegetais e condições de incubação (GIRI et al., 2004).
Até o presente momento existem poucos estudos relacionados à micropropagação de E. benthamii x E. dunnii (BRONDANI et al., 2009 e 2011), sendo que os trabalhos visaram definir as melhores condições para o estabelecimento in vitro, multiplicação e alongamento de três clones distintos, não sendo contemplada a regeneração de gemas adventícias. Entretanto, há relatos sobre a micropropagação de outros híbridos, como E. tereticornis x E. camaldulensis (BISHT et al., 1999), E. tereticornis x E. grandis (JOSHI et al., 2003), E. erythronema x E. stricklandii (GLOCKE et al., 2006) e E. grandis x E. urophylla (PEREIRA- NETTO et al., 2006; ALCANTARA et al., 2011), dentre outros.
Com isso nota-se a carência de informações fundamentais sobre o processo de organogênese em eucalipto, necessário para a transformação genética. Além disso, de acordo com Grattapaglia e Machado (1998), a variabilidade na resposta morfogenética in vitro existe, não apenas entre espécies do mesmo gênero, mas também entre genótipos da mesma espécie (diferentes cultivares e clones), sendo necessária a definição de protocolos diferenciados.
Além disso, a eficiência da regeneração em cultura de tecidos tem sido descrita como uma característica quantitativa, que varia frequentemente entre espécies vegetais e dentro de uma mesma espécie, entre subespécies, variedades, cultivares ou ecotipos. Variações na regeneração de brotos são prejudiciais especialmente quando se trata de clones elite (DECOOK et al., 2006).
Tecidos e órgãos de plantas são cultivadas in vitro, em meios artificiais, que fornecem os nutrientes necessários para o crescimento. O sucesso da cultura de tecidos como forma de propagação de plantas é fortemente influenciado pela natureza do meio de cultura utilizado (GEORGE et al., 2008). Para um crescimento normal e vigoroso sob condições in vitro, uma planta requer elementos no meio de cultura como os macronutrientes, micronutrientes, reguladores vegetais, vitaminas, aminoácidos e outros compostos nitrogenados e fontes de carbono (açúcares) (YASEEN et al., 2013). Em várias espécies do gênero Eucalyptus, a influência exercida pela composição dos meios de cultura tem sido estudada na organogênese (QUISEN et al., 2009). Dibax et al. (2010a) estudaram a influência dos meios de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), WPM (LLOYD e MCCOWN, 1980) e JADS (CORREIA et al., 1995), adicionados de 2,7 µM de ácido naftalenoacético (ANA) e 4,4 µM de benzilaminopurina (BAP), na organogênese de explantes cotiledonares de E. camaldulensis. Estes autores obtiveram maior formação de brotações com a utilização dos meios MS e WPM, 57,5 e 55% respectivamente, enquanto que no meio JADS houve formação de brotos em apenas 35% dos explantes. Esses resultados demonstram que o meio de cultura utilizado exerce influência nessa fase, o que explica a diferença nas taxas de regeneração encontradas, mesmo quando utilizada a mesma combinação e concentração de reguladores vegetais.
De maneira geral, grande parte dos trabalhos com espécies de Eucalyptus também relataram o uso de thidiazuron (TDZ), em concentrações que variam de 0,05 a 2,5 µM, para a indução de calos a partir de diferentes tecidos, como, por exemplo, folhas (DIBAX et al., 2010b) e folhas cotiledonares (AZMI et al., 1997; NUGENT et al., 2001). Contudo, BAP também tem sido utilizado como regulador vegetal estimulante da fase de calogênese em explantes foliares de diversas espécies do gênero Eucalyptus, apresentando um efeito positivo durante a fase inicial da regeneração. Dentre essas espécies pode-se mencionar E.
camaldulensis (MULLINS et al., 1997), E. globulus (MORALEJO et al., 1998), E. grandis (LAINÉ e DAVID, 1994; MACHADO et al., 1997), E. grandis x E. urophylla (TOURNIER et al., 2003) e E. gunnii (HERVÉ et al., 2001).
Segundo Glocke et al. (2005), em Eucalyptus erythronema, E. stricklandii, E. erythronema x E. stricklandii cv. ‘Urrbrae Gem’ e o “Hibrido 2.5”, BAP induziu a regeneração de brotações a partir de hipocótilos e cotilédones, mas em folhas, a organogênese foi mais difícil. Em pau-brasil (ARAGÃO et al., 2011), a utilização de BAP estimulou a formação de calos em segmentos nodais de forma significativa em todas as concentrações testadas (2,5; 3,5 e 4,5 µM). A combinação de 0,54 µM de ANA e 3,3 µM de BAP promoveu a maior taxa de calogênese (96,88%) em Casuarina cunninghamiana (JIANG et al., 2012).
Na micropropagação de espécies de Eucalyptus, de acordo com Del Ponte et al. (2001), BAP tem sido o regulador vegetal mais utilizado em meio de cultura, para e estimulação e proliferação de gemas axilares (SANKARA-RAO, 1998; TRINDADE et al., 1990; NICCOL et al., 1994).
A oxidação fenólica é um problema encontrado frequentemente na micropropagação de plantas perenes, como eucalipto, manga, banana, dentre outros (BARRUETO CID; TEIXEIRA, 2010). Segundo estes autores, além do carvão ativado e do PVP (polivinilpirrolidona), existem outros produtos que podem prevenir a oxidação, como o ácido cítrico, o ácido ascórbico, a L-cisteína, dentre outros.
Diante disto, este trabalho teve como objetivos verificar o efeito de diferentes reguladores vegetais, antioxidantes e diferentes composições salinas dos meios de cultura durante a organogênese indireta, a partir de folhas de E. benthamii x E. dunnii, e estudar a influência de diferentes composições salinas do meio durante a fase de multiplicação dos brotos.