Mise au point d’un modèle cellulaire non sécrétant dépourvu de la Chromogranine A

2.3.1. Présentation des lignées générées PC12 CgA

-Dans l’optique d’inhiber exclusivement la fonction de sécrétion sans modifier radicalement le transcriptome des cellules, nous avons tenté deux approches complémentaires toutes deux basées sur le pouvoir granulogénique de la chromogranine A (CgA) (Kim et al., 2001). La première approche a été de tenter de restaurer la sécrétion dans les clones non sécrétants C-27 et A35C par expression de la CgA. En effet, il a déjà été montré que la CgA était capable de restaurer la granulogénèse dans les clones A35C (Courel et al., 2006). De plus, Courel et collaborateurs montrent que l’exocytose régulée par le calcium et induite par un sécrétagogue est restaurée dans ces clones A35C ré-exprimant la CgA. Nous avons donc généré des lignées stables suite à l’infection des clones C-27 et A35C avec des lentivirus contenant l’ADN codant pour la CgA. Malheureusement, nous n’avons pas obtenu les mêmes résultats puisque ni la granulogénèse ni les capacités sécrétrices ne sont restaurées dans nos clones C-27^CgA+ et A35C^CgA+ (non montré). Pour le moment, nous les avons donc écarté de l’étude (voir partie discussion).

La deuxième approche a consisté à bloquer spécifiquement la granulogénèse dans les PC12 sauvages. Pour cela nous avons établi une collaboration avec l’équipe «Génomique Fonctionnelle et Physiopathologie Neuroendocrine » du laboratoire de l'Unité INSERM 982 « Différenciation et communication neuronale et neuroendocrine » dirigée par le Dr. Youssef Anouar à Rouen. Cette équipe, spécialiste de la granulogenèse dans les cellules neuroendocrines ainsi que dans la biologie des phéochromocytomes, a récemment généré des clones de cellules PC12 exprimant de façon stable des ARN interférents (shRNA) dirigés contre la CgA (non publié). L’inhibition transitoire de l’expression de la CgA par des siARN étant déjà connue pour bloquer la granulogenèse (Courel et al., 2006), ces lignées représentent un bon outil pour apprécier le rôle de la sécrétion des granules dans la croissance tumorale.

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L'équipe de Rouen a généré par infection virale deux lignées exprimant chacune un shRNA différent dirigé contre la CgA (PC12^CgA(1)- et PC12^CgA(2)-) ainsi qu’une lignée contrôle exprimant un shRNA contenant une séquence aléatoire ne ciblant aucun ARN connu chez le rat (pour les détails techniques, se référer au chapitre matériel et méthodes). Dans un premier temps, nous avons vérifié l’efficacité de l’inhibition de l’expression de la CgA dans ces deux clones (FIGURE 18). Comme il a déjà été montré que l’inhibition de l’expression d’une granine peut altérer le niveau d’expression des autres granines (Mahapatra et al., 2005; Montesinos et al., 2008), nous avons également analysé l’expression de la chromogranine B (CgB) et de la sécrétogranine (SgII). L’expression de la CgA est bien inhibée dans le clone PC12^CgA(1)- tandis que le clone PC12^CgA(2)- conserve une expression faible de la protéine. De façon surprenante, l’expression de la CgB et de la SgII est égalemement inhibée dans le clone PC12^CgA(1)- mais pas dans le clone PC12^CgA(2)- qui conserve un niveau d’expression de ces deux granines comparable aux cellules contrôles. Ainsi, nous avons généré un clone cellulaire dépourvu de l’expression simultanée des trois granines CgA, CgB et SgII (PC12^CgA(1)-) et un clone dont seule l'expression de la CgA est spécifiquement inhibée (PC12^CgA(2)-).

FIGURE 18. Expression des granines CgA, CgB et SgII dans les lignées PC12^CgA-. Immunodétection des granines par Western-Blot. (A) Illustration d’une membrane de western blot après révélation de l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (B) Quantification de l’expression des granines en pourcentage d’expression par rapport aux cellules contrôles. PC12 CT = PC12 contrôles exprimant un ShRNA contrôle ; PC12CgA(1)- et PC12CgA(2)-= PC12 exprimant chacune un ShRNA différent dirigé contre la CgA.

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47 Dans un deuxième temps, nous avons voulu analyser l'effet de l'inhibition des granines sur la granulogenèse. Pour cela, nous avons observé le contenu en granules de chaque lignée cellulaire par microscopie électronique (FIGURE 19). A l’instar des PC12 sauvages, les cellules contrôles exprimant un shRNA contrôle contiennent des granules. En revanche, les deux clones dont l'expression de la CgA est inhibée se comportent différemment. En effet, nous pouvons observer que les cellules issues des clones PC12^CgA(2)- contiennent des granules à coeur dense tandis que le clone PC12^CgA(1)- en est totalement dépourvu. Selon moi, ce résultat peut être expliqué de deux façons. Soit l’expression résiduelle de la CgA dans les clones PC12^CgA(2)- est suffisante pour générer des granules, soit une inhibition simultanée des trois granines est nécessaire pour bloquer totalement la granulogénèse dans les PC12. Enfin, notez qu'à ce stade de l'expérience, nous n'avons pas quantifié la proportion de granules dans chaque type de lignées.

FIGURE 19. Caractérisation ultrastructurale des différents clones CgA-. Photos prises au microscope électronique, illustrant les granules de sécrétion dans les différents clones indiqués par des flèches rouges. Seuls les clones PC12CgA(1)- en sont totalement dépourvus. PC12 CT = PC12 contrôles exprimant un ShRNA contrôle ; PC12CgA(1)- et PC12CgA(2)-= PC12 exprimant chacune un ShRNA différent dirigé contre la CgA.

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2.3.2. Caractérisation du profil sécrétoire des lignées PC12 CgA

-Parmi les lignées dont l'expression de la CgA est inhibée, une lignée est totalement dépourvue de granules tandis que dans l’autre, il semble persister une activité granulogénique résiduelle. Qu'en est-il des capacités sécrétrices de ces cellules ? De la même manière que les expériences décrites précédemment, j’ai comparé le profil sécrétoire des différents clones en mesurant les catécholamines par dosage ELISA (FIGURE 20). Comme les cellules PC12, les cellules PC12contrôles exprimant un shRNA non spécifique ainsi que les clones PC12^CgA(2)- contiennent exclusivement de la dopamine. En revanche, aucune des trois catécholamines n’a pu être détectée dans le clone PC12^CgA(1)-qui n'exprime ni la CgA, ni la CgB ni la SgII (FIGURE 20A). Concernant l'activité sécrétrice régulée induite par un sécrétagogue, les cellules PC12contrôles ainsi que les cellules PC12^CgA(2)- sécrètent la même quantité de dopamine que les PC12 sauvages (FIGURE 20B).

FIGURE 20. Caractérisation du profil sécrétoire des cellules PC12 CgA-. (A) Concentration de dopamine totale en pg/1000 cellules (B) Sécrétion de dopamine en pourcentage, au repos et après stimulation par une solution dépolarisante contenant 59mM de potassium. Le dosage des catécholamines est réalisé par méthode ELISA. PC12 CT=PC12 contrôles exprimant un ShRNA contrôle ; PC12^CgA(1)- et PC12^CgA(2)-=PC12 exprimant chacune un ShRNA différent dirigé contre la CgA Les résultats sont présentés en moyenne de 3 expériences indépendantes, ± SEM.

En conclusion, nous possédons plusieurs outils intéressants: i) les cellules PC12contrôles capables de synthétiser, stocker et sécréter la dopamine ; ii) les cellules PC12^CgA(2)- dont l’expression de la CgA est inhibée mais pas complétement abolie et dont la granulogénèse et la fonction sécrétrice sont préservées et enfin iii) les cellules PC12^CgA(1)- n’exprimant plus du

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49 tout les granines CgA, CgB et SgII et dont la granulogénèse et la capacité à synthétiser la dopamine sont totalement inhibées. Ainsi, le clone PC12^CgA(1)- constitue un bon modèle non sécrétant pour l’étude de l’impact de la sécrétion sur le développement tumoral. De plus, le clone PC12^CgA(2)- est très intéressant puisque ses capacités sécrétrices sont conservées mais le niveau d'expression de la CgA diffère par rapport aux cellules PC12 contrôles. Or de nombreuses données relatent d’une implication de la CgA dans le processus tumoral (Corti, 2010). C’est pourquoi nous avons décidé de tirer profit de l’obtention de ce clone présentant une inhibition de la CgA pour étudier spécifiquement le rôle de cette dernière dans la croissance tumorale des cellules PC12.