Comparaison de la croissance tumorale des cellules PC12, C-27 et A35C in vivo

in vivo

La technique de xénogreffes chez des souris immunodéficientes Nude permet de suivre la croissance tumorale induite par l’injection sous-cutanée de cellules PC12 (Zielke et al., 1998; Denorme et al., 2014). En utilisant cette approche, j’ai analysé la croissance tumorale des trois lignées cellulaires (PC12, C-27 et A35C) que j’ai injecté en sous cutané chez quarante souris femelles immunodéficientes de type Nude NMRI-nu (RjOrl:NMRI-Foxn1nu

/Foxn1^nu). En contrôle, nous avons injecté une cohorte de dix souris avec une solution saline ne contenant pas de cellules. Aucune des souris contrôles n’a développé de tumeurs (non montré). En revanche, chacune des lignées cellulaires injectées est capable d’induire et de développer des tumeurs sous-cutanées (FIGURE 17B). De façon intéressante, la croissance des tumeurs dérivant des clones C-27 et A35C est fortement retardée par rapport à la croissance tumorale induite par les PC12 sauvages. En effet, pour un volume tumoral de 0,8 cm³, le retard de croissance est respectivement de 27,7 et 59,8 jours pour les cellules C-27 et A35C, par rapport aux PC12. De plus, il est intéressant de noter également un retard de l’initiation de la tumeur. En effet, le volume d’initiation de la tumeur (fixé à 5mm³ ; voir matériel et méthodes pour détails), est atteint avec un retard respectif de 6,81 et 26,1 jours pour les clones C-27 et A35C par rapport aux cellules PC12. Enfin, concernant la vitesse de développement des tumeurs, j’ai pu observer que le volume des tumeurs dérivant des clones A-35C et C-27 présentent un temps de doublement plus élevé que celui des tumeurs dérivant des PC12 sauvages (36,5 ; 22,7 et 7,4 jours, respectivement), indiquant une vitesse de développement moindre pour les clones non sécrétants (voir TABLEAU 6 pour résumé des caractéristiques).

Tout du long de l’expérience de xénogreffes, j’ai également dosé la dopamine dans le plasma des souris Nude afin de vérifier si les cellules conservaient bien leurs capacités sécrétrices in

vivo (FIGURE 17C). Dans les souris injectées avec les cellules PC12, la concentration circulante de dopamine augmente proportionnellement au volume de la tumeur tandis que la concentration plasmatique de dopamine des souris ayant reçu l’injection des clones non sécrétants reste au même niveau que celle des souris contrôles (0,01 µg/ml ± 0,001). En effet, la concentration circulante de dopamine et le volume de la tumeur sont étroitement liés chez les souris ayant reçu l’injection de PC12 comme l’indique le coefficient de spearman

Chapitre Un Résultats

43 qui est compris entre 0,8 et 0,9 ( =0,84). En revanche, la valeur du coefficient chez les souris ayant reçu l’injection de C-27 et A35C se situe en dessous de 0,5 indiquant que les !variables sont faiblement liées. Ces dosages confirment donc que les trois lignées injectées conservent leur phénotype sécrétoire respectif in vivo.

FIGURE 17. Croissance tumorale des cellules PC12, C-27 et A35C in vivo. (A) Protocole de xénogreffe

des cellules chez les souris Nude. Les cellules sont injectées chez les souris en sous-cutané puis le volume de la tumeur est mesuré tous les trois jours. En parallèle, un prélèvement sanguin sous mandibulaire hebdomadaire est réalisé afin de doser la dopamine plasmatique des souris (B) En haut, illustration des tumeurs au 21^ème jour pour les trois groupes de souris. En bas, graphique représentant la croissance tumorale pour les trois groupes de souris ayant reçu les injections de cellules. Moyenne ± SEM, n=10 souris par condition ; *** p<0,001, test des rangs de Friedman (C) Graphique représentant le volume de la tumeur en fonction de la concentration de dopamine plasmatique pour les souris ayant reçu l’injection de PC12, C-27 ou A35C. : corrélation de Spearman par rang.

Chapitre Un Résultats 44 PC12 C-27 A35C T doublement 7,4 ± 0,7 22,7 ± 4,1 *** 36,5 ± 4,6 *** Retard au V=0,8cm³ 27,7 *** 59,8 *** Retard au V=5mm³ 6,81 ** 26,1 ***

TABLEAU 6. Résumé des caractéristiques des tumeurs dérivant des PC12, C-27 et A35C. Le temps de

doublement correspond au temps nécessaire pour que la tumeur double de volume ; les retards aux V=0,8cm3 et V=5mm3 correspondent au délai pour atteindre les volumes de 0,8cm3 et 5mm3, respectivement, par rapport aux cellules PC12. n= 10 souris par conditions, ± SEM, test de Kruskal-Wallis, ***p<0,001 et **p<0,01 par rapport aux PC12.

L’ensemble de ces résultats indique que le développement dérivant des clones non sécrétants A35C et C-27 est fortement perturbé. En effet, les deux clones non sécrétants mettent plus de temps à initier la tumeur et le développement tumoral qui s’ensuit est beaucoup moins rapide que celui des PC12. De plus, il est intéressant de noter que le développement des tumeurs dérivant des A35C ne synthétisant pas de catécholamines est beaucoup moins rapide que celui des tumeurs dérivant des cellules C-27, qui semblent être capables de sécréter une faible quantité de dopamine dans le milieu extracellulaire. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que le retard très important du développement des tumeurs dérivant des clones A35C par rapport aux C-27 reflète en partie des capacités tumorigènes moindres in vitro. En revanche, mes données in vitro permettent de confirmer que le retard de croissance tumorale des C-27 n’est pas la conséquence d’une plus faible vitesse de prolifération ou tumorigénicité que les cellules PC12.

Comme je l’ai mentionné précédemment, les clones A35C et C-27 sont caractérisés par l’expression d’un facteur de transcription REST, responsable de la répression de la transcription des gènes impliqués dans la voie de sécrétion régulée. Cependant, des études ont montré l’existence d’une très grande diversité de gènes cibles du facteur REST. Nous pouvons citer par exemple les gènes codant pour des facteurs nucléaires, des récepteurs, ou encore des gènes impliqués dans le métabolisme (Bruce et al., 2004). Les gènes cibles de REST étant multiples, il n’est pas exclu que ce facteur puisse inhiber l’expression de gènes codant pour des protéines impliquées dans un mécanisme affectant le développement tumoral. Ainsi, la réduction de la vitesse de la croissance tumorale observée pour ces deux clones n’est peut être pas uniquement liée à la fonction de sécrétion mais pourrait être la résultante de plusieurs facteurs. Or, nous aimerions connaître la contribution réelle de la

Chapitre Un Résultats

45 sécrétion dans le retard du développement tumoral. La suite de notre travail a donc consisté à tenter de créer d’autres modèles expérimentaux de cellules PC12 dont seule la sécrétion est bloquée.

2.3. Mise au point d’un modèle cellulaire non sécrétant dépourvu de la