res de la TVPC
6. Mise en évidence d’une mosaïque somatique
1 PCR allèle spécifique (PCR-ARMS Amplification Refractory Mutation System) L’existence d’une mosaïque germinale et somatique pour la mutation c.7202G>A dans l’exon 47 du gène RYR2 a été évoquée chez l’individu I:2 de la famille 33. La méthode de PCR-ARMS est utilisée pour mettre en évidence la présence de l’allèle muté au niveau de l’ADN leucocytaire chez cette patiente. Trois amorces différentes ont été conçues : une amorce sens commune localisée à la fin de la partie 5’ de l’exon 47 (5’-GT TCC TCC TTT TCC CCT CA-3’), et deux amorces antisens spécifiques, l’une de l’allèle sauvage et l’autre de l’allèle muté, divergeant par le nucléotide c.7202 en 3’ : respectivement 5’-ATG CAT CTC AGG AGC GC-3’ et 5’-ATG CAT CTC AGG AGC GT-3’. Deux PCR sont réalisées : une avec l’amorce commune et l’amorce spécifique de l’allèle sauvage et une avec l’amorce commune et celle spécifique de l’allèle mutée. L’amplification de l’ADN dans les deux conditions démontre l’existence de l’allèle muté et de l’allèle sauvage chez l’individu analysé. Un témoin
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homozygote sain est utilisé comme contrôle pour valider la spécificité de la PCR utilisant l’amorce spécifique de l’allèle muté.
1 Détermination semi-quantitative du taux de mosaïcisme somatique par HRM
Le taux de mosaïcisme pour l’allèle muté dans l’ADN de l’individu I:2 de la famille 33 est estimé de manière semi-quantitative par HRM. L’amplification PCR et l’analyse HRM sont réalisées comme décrit dans le paragraphe précédent (Light Cycler ® 480, Roche, France). L’ADN (hétérozygote G/A) du proband est mélangé avec un ADN contrôle (homozygote G) à des dilutions de 10, 25, 50, 75 et 90 %. L’ADN du proband, les dilutions réalisées et l’ADN contrôle permettent d’obtenir une gamme semi-quantitative d’ADN muté. Des ADN extraits à partir de cellules buccales, urinaires et leucocytaires maternelles sont analysés par HRM.
1 Estimation du taux de mosaïcisme leucocytaire par séquençage des clones obtenus par Topo TA cloning à partir du produit PCR de l’ADN leucocytaire du patient.
L’existence d’une mosaïque germinale et somatique pour la mutation c.11836G>A ; p.G3946S dans l’exon 88 du gène RYR2 a été évoquée chez l’individu I:1 de la famille 46. La présence de l’allèle muté à l’état de mosaïque est recherchée par séquençage des clones obtenus à partir du produit d’amplification PCR de l’ADN leucocytaire maternel. L’exon 88 et ses bornes introniques sont amplifiés par PCR à partir de l’ADN leucocytaire. Les produits PCR obtenus sont clonés dans le plasmide pCR2.1 en utilisant le kit de clonage TopoTA selon les recommandations du fabriquant (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Les ADN de soixante-douze clones sont extraits et séquencés sur un séquenceur ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer. Le taux de mosaïcisme est estimé en déterminant le taux de clones porteurs de la séquence mutée (% de mosaïcisme = % de clones mutés x 2).
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La nature de la variation est fondamentale pour évaluer son caractère pathogène. Les mutations non-sens, les microdélétions, les microinsertions et les mutations d’épissage entraînent une modification importante de la séquence protéique ou un décalage du cadre de lecture responsable de l’apparition d’un codon stop prématuré. La présence d’un codon stop prématuré entraine soit la synthèse d’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable, soit la dégradation de l’ARNm via le mécanisme nonsense mediated mRNA decay (NMD, (Khajavi et al., 2006)). Le caractère causal ou pathogène de ces mutations est admis. Par contre, les variations faux-sens, les variations synonymes ou les changements affectant les séquences introniques peuvent être plus sujettes à discussion.
Nous avons utilisé différents critères pour définir le caractère pathogène d’une variation faux-sens (Cotton and Scriver, 1998; Richards et al., 2008) :
1. Degré de conservation de l’acide aminé
2. Nature du changement physico-chimique de l’acide aminé 3. Prévalence de la mutation
4. Ségrégation de la mutation avec la pathologie dans la famille 5. Analyse fonctionnelle de la mutation.
Les études directes prouvant la causalité fonctionnelle des mutations faux-sens ne sont pas toujours réalisables et seuls les 4 premiers critères sont alors retenus.
Une variation est considérée comme polymorphe (non pathogène) lorsqu’elle est retrouvée dans une population contrôle à une fréquence supérieure à 1% ou lorsqu’elle est répertoriée comme polymorphisme dans les bases de données de variants (NCBI SNP database, 1000 genomes project, Genome Variation Server, Exome Variation Server). On notera toutefois que la prévalence des mutations récessives dans une population témoin n’est pas nulle.
Dans notre étude, une variation faux-sens est retenue comme probablement pathogène si :
- elle modifie un acide aminé conservé,
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- elle est absente d’une population contrôle de 200 individus (400 chromosomes) pour une variation dominante ou si elle est absente ou existe isolée à l’état hétérozygote pour une variation récessive,
- elle ségrége avec la pathologie dans la famille - elle est survenue chez le proband (mutation de novo) - elle est déjà décrite dans la pathologie
- elle a été validée fonctionnellement.
La probabilité du caractère pathogène de la variation a également été évaluée à l’aide de logiciels de prédiction (SIFT, Polyphen, SNPs3D, Pmut, SNPsandGO, SNAP, adresses des sites informatiques dans le chapitre spécifique en fin de document).
Le caractère pathogène des variations synonymes ou des changements affectant les séquences introniques, en dehors des sites consensus d’épissage donneur GT et accepteur AG, est évalué sur des critères proches :
- la prévalence de la variation dans la population estimée en recherchant la mutation dans une population contrôle de 200 individus
- la conservation du nucléotide affecté
- sa position dans la séquence (inhibition ou abolition des sites d’épissage existants, création ou activation de sites cryptiques)
- la ségrégation du variant avec la pathologie dans la famille - l’analyse des transcrits.
L’impact sur l’épissage d’une variation synonyme ou intronique est prédit à l’aide de logiciels de prédiction (NetGene2, Gene Splicer et Automated Splice Site Analyses). La validation fonctionnelle de la variation est réalisée à l’aide d’un minigène d’épissage.