Chapitre II: Conception et synthèse de dérivés du dipeptide Arg-Phe en tant que
3. Dérivation du dipeptide N-(4-phényléthynylbenzoyl)-Arg-Trp-NH 2
3.2. Mise au point de la double réaction de Sonogashira sur phase solide
La réaction de Sonogashira a été optimisée sur le dipeptide Arg-Phe-NH-Rink, pour des raisons de simplicité d’analyse par HPLC, car nous avons observé une déprotection en deux temps du Boc porter par l’indole du Trp. Lors du clivage des composés comportant le Trp, à l’aide du TFA, deux composés au profil UV semblable sont obtenus. Le ratio entre ces deux
produits varie au cours du temps pour ne former que le composé le plus polaire. Des analyses RMN-C13ont montré la présence d’un groupe CO2résiduel.
La mise au point a été réalisée sur un même lot de résine Rink amide (cf annexe 1) greffée par du 4-iodobenzoyl-Arg(Pbf)-Phe. Le triméthylsilylacétylène est introduit par réaction de Sonogashira dans des conditions classiques, utilisant le duo PdCl2(PPh3)2/CuI en présence d’Et3N dans le DMF à t.a. durant 8h.75 Le DMF a été choisi comme solvant car il est compatible avec ce type de réaction pallado-catalysée et il permet de gonfler le polymère de la résine. Le dépliement du polystyrène permet de limiter la gêne stérique autour du dipeptide. Ainsi le métal pourra plus facilement avoir accès aux liaisons carbone-halogène ce qui favorisera la réaction pallado-catalysée.
a) DBU, pipéridine, DMF, t.a., 30min; b) Fmoc-Phe-OH, BOP, DIEA, CH2Cl2, t.a., 2h; c) Fmoc-Arg(Pbf)-OH, BOP, DIEA, CH2Cl2, t.a., 2h; d) acide 4-iodobenzoique, BOP, DIEA, CH2Cl2, t.a., 2h; e) triméthylsilylacétylène, PdCl2(PPh3)2, CuI, Et3N, DMF, t.a., 8h; f) TBAF, THF, t.a., 3h; g) ArX, 5% "Pd", 10% "ligand", 10% CuI, "base", DMF; h) TFA, TIS 3%, t.a., 2x45min.
Schéma 16 : Synthèse générale des dérivés alcynes
Le groupe silyle est ensuite déprotégé par du TBAF dans le THF durant 3h.76 Cette réaction ne peut être suivie par HPLC, car la déprotection du triméthylsilyle se produit également en milieu TFA utilisé pour le clivage des composés de la résine. L’alcyne vrai 72 est obtenu après clivage de 71 et trituration à l’Et2O, avec une pureté supérieure à 95% à 210nm.
N H N H NH2 O O NH NH2 N H O H 72
Figure 11 : HPLC à 210nm du dérivé alcyne 72 obtenu après 9 étapes de synthèse
Le couplage entre un alcyne vrai fixé à la résine et un halogénure d’aryle est peu décrit dans la littérature, et il n’existe pas d’exemple sur des peptides.
Le second couplage de Sonogashira a été réalisé avec l’iodobenzène. Les conditions classiques utilisées précédemment pour l’introduction du triméthylsilylacétylène, ont conduit à un faible taux de conversion de l’alcyne de départ, lorsqu’il est mis en réaction avec l’iodobenzene (entrée 1: rendement global: 10%). Les rendements ont été analysés par dosage HPLC. Le protocole a été le suivant: après clivage du composé et évaporation du TFA, le résidu obtenu est solubilisé dans une solution de MeOH contenant de la caféine (1mg/mL) comme étalon interne. Après dilution, la solution obtenue est passée en HPLC. Deux droites d’étalonnage du composé attendu et de la caféine ont été réalisées, pour avoir une analyse fiable des rendements de la réaction. L’ensemble des résultats obtenus lors de la mise au point de la réaction de Sonogashira sur support solide se trouve dans le tableau 16.
Pour commencer cette étude, nous avons fixé la température de réaction à t.a., puis nous avons augmenté la quantité de base pour passer à un ratio 1/1 avec le solvant, ce qui a permis une amélioration du rendement (entrée 2). Le remplacement de l’Et3N par la pipéridine n’affecte pas la réactivité (entrée 3). L’utilisation du bromobenzène dans ces conditions réactionnelles laisse le produit de départ inchangé (entrée 4). C’est sur l’insertion du
bromobenzène que notre travail s’est concentré. Nous avons pu observer la formation du produit attendu (13%) lorsque le milieu réactionnel est chauffé aux micro-ondes à 80°C durant 2min (entrée 5). Un chauffage plus long (20min) ne permet pas d’améliorer le rendement (entrée 6). Cette conversion n’étant pas satisfaisante, nous avons modifié le complexe de palladium (entrée 7 à 12). Les différents complexes choisis pour cette étude se retrouvent couramment dans la littérature décrivant la réaction de Sonogashira. Le meilleur rendement est obtenu avec le Pd(P(tBu)3)2 (entrée 10: 42%). Ce palladium est peu stable à l’air et difficile à conserver dans le temps s’il n’est pas stocké dans une boite à gant. Il est cependant possible de générer ce complexe in-situ et l’équipe de G. Fu a montré que le couple Pd(PhCN)2Cl2/P(t-Bu)3 permettait de faire des réactions de Sonogashira sur des composés arylbromés à t.a.77 Le ligand P(t-Bu)3 montre la même sensibilité à l’oxydation que le complexe Pd(P(tBu)3)2. C’est pourquoi l’ équipe de G. Fu a développé un précurseur stable P(tBu)3.HBF4, sous la forme d’un sel de bore.78Commercialement disponible, P(tBu)3.HBF4a été mis en réaction avec les différents complexes de palladium préalablement testés. Nous avons pu observer une nette amélioration des résultats (entrée 14 à 18: 28-39% de rendement global). Par la suite nous avons choisi de poursuivre l’étude avec le couple Pd(PhCN)2Cl2/ Pt-Bu3.HBF4 (entrée 18). L’augmentation du temps de réaction aux µw de 2min à 20min, ne permet pas d’augmenter les rendements (entrée 19). La littérature décrivait l’utilisation de ce système pour la réaction de Sonogashira à t.a., mais dans le cas de cette synthèse supportée, la réaction attendue n’est pas obtenue avec le bromobenzène (entrée 20) et 23% du produit attendu est obtenu avec l’iodobenzene (entrée 21). La même réaction au µw (2min, 80°C) avec l’iodobenzène conduit à 43% de produit attendu (entrée 22). L’utilisation du chlorobenzène ne conduit qu’à des traces de produit de couplage (entrée 23).
Entrée X "Pd" Ligand Sol./Base T° Tps Rdt sur 9 étapes 1 I Pd(PPh3)2Cl2 / DMF/Et3N (3èq) 30 16h 10 2 I Pd(PPh3)2Cl2 / DMF/Et3N 30 16h 17 3 I Pd(PPh3)2Cl2 / DMF / Pip. 30 16h 13 4 Br Pd(PPh3)2Cl2 / DMF / Pip. 30 16h 0 5 Br Pd(PPh3)2Cl2 / DMF / Pip. 80 2min 13 6 Br Pd(PPh3)2Cl2 / DMF / Pip. 80 20min 12 7 Br Pd(PPh3)4 / DMF / Pip. 80 2min 18
8 Br Pd2(dba)3 PPh3 DMF / Pip. 80 2min 8
9 Br Pd(dppf)Cl2 / DMF / Pip. 80 2min 8
10 Br Pd(P(tBu)3)2 / DMF / Pip. 80 2min 42
11 Br Pd(MeCN)2Cl2 / DMF / Pip. 80 2min 15
12 Br Pd(PhCN)2Cl2 / DMF / Pip. 80 2min 16
13 Br Pd(PhCN)2Cl2 iPr.HCl DMF / Pip. 80 2min 7
14 Br Pd(OAc)2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 30
15 Br Pd(PtBu3)2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 28
16 Br Pd(MeCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 33
17 Br Pd(PPh3)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 39
18 Br Pd(PhCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 31
19 Br Pd(PhCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 20min 34
20 Br Pd(PhCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 30 16h 0
21 I Pd(PhCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 30 16h 23
22 I Pd(PhCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 43
23 Cl Pd(PhCN)2Cl2 P(tBu)3.HBF4 DMF / Pip. 80 2min 1
Tableau 16 : Mise au point de la réaction de Sonogashira sur support solide
On peut noter que les meilleurs rendements globaux obtenus (entrées 10, 17, 19 ou 22) restent inférieurs à 50%, alors que la pureté HPLC des échantillons après précipitation était supérieure à 85%. Nous nous sommes alors demandé d’où venait cette baisse de rendement. Nous avons pu par dosage du Fmoc estimer que le rendement des couplages des acides aminés Phe et Arg étaient d’au moins 95% (annexe 1). Après chaque réaction de Sonogashira et déprotection du silyle, les solvants de réaction ont été récupérés, concentrés et analysés par LC/MS, sans montrer la présence de dérivés peptidiques potentiellement clivés de la résine pendant la réaction pallado-catalysée. De plus, l’introduction en une seule réaction de Sonogashira du phénylacétylène ne conduit qu’à 44% du dipeptide attendu. L’ensemble de ces résultats semble indiquer que le dipeptide formé reste accroché à la résine. Très riche en noyaux aromatiques hydrophobes, on peut émettre l’hypothèse d’interactions avec les noyaux styrènes de la résine. Une manière de valider partiellement cette hypothèse consisterait à lancer cette synthèse en utilisant un autre type de résine, tel que celle contenant du polyéthylène glycol (ex: Tentagel) qui permet d’éloigner le peptide synthétisé de la partie polystyrène.
Figure 12 : HPLC à 210nm de composé 46c obtenu après la double réaction de Sonogashira
En appliquant les conditions optimisées, 5% Pd(PhCN)2Cl2/10% P(tBu)3.HBF4, 10% CuI, DMF/Et3N, µw, 10min à 80°C, sur le dipeptide N-(4-éthynylbenzoyl)-Arg-Trp fixé au support solide, les composés 66a-h ont été synthétisés:
N H O N H NH NH2 N H O NH2 O Ar NH 66a-h
Tableau 17 : Rendements obtenus pour la synthèse des dérivés N-(4-aryléthynylbenzoyl)-Arg-Trp-NH2
Nous pouvons remarquer que les rendements isolés présentés dans le tableau 17 sont sensiblement meilleurs avec le dipeptide Arg-Trp qu’avec le dipeptide Arg-Phe (tableau 16). Ce résultat renforce l’hypothèse d’une interaction des noyaux aromatiques hydrophobes avec la résine polystyrène.