Mise au point des conditions de repliement sur la protéine synthétique

La protéine issue de la synthèse se comporte différemment, afin d’étudier les meilleures conditions de repliement sur la protéine synthétique, les expériences de repliement oxydatif sont réalisées avec la protéine issue de la synthèse.

RESULTATS ET DISCUSSION

III. 2)1) Influence du pH

Tableau 10 – Conditions de repliement oxydatif de la protéine AhPDF1

Il est connu que le pH influence le repliement oxydatif des protéines. L’effet du pH a été testé sur la protéine TxIB. A pH 6, la protéine ne se replie pas, alors qu’entre pH 7 et 9, la protéine TxIB se replie. Elle atteint un rendement de repliement maximal de 91% à pH 8 (Wu et al., 2013). Le pH a été testé entre 7 et 8,5 pour la protéine AhPDF1, à température ambiante.

Figure 75 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif à pH 7 (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Figure 76 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif à pH 7,5 (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Solution Concentration finale

AhPDF1 12 µM Tris pH 7 à 8,5 100 mM EDTA 1 mM GSH 1,2 mM GSSG 0,12 mM H2O qsp 101

RESULTATS ET DISCUSSION

Figure 77 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif à pH 8 (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Figure 78 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif à pH 8,5 (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Figure 79 – Cinétique du repliement oxydatif de la protéine AhPDF1 en fonction du pH (7 ; 7,5 ;

8 ; 8,5)

RESULTATS ET DISCUSSION Plus le pH est élevé, plus la quantité de protéine repliée augmente et plus la vitesse du repliement augmente. Sans ajout de co-solvant à température ambiante et à pH 8,5 le repliement oxydatif atteint un rendement de 57 % en 6 h (Figure 79). Comme la protéine issue des bactéries, la protéine synthétique se replie mieux à pH élevé. Pour les prochains

repliements oxydatifs, on se placera donc à pH 8,5.

III. 2) 2) Influence du co-solvant

Tableau 11 – Conditions de repliement oxydatif de la protéine AhPDF1

Figure 80 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif sans co-solvant (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Solution Concentration finale

AhPDF1 12 µM Tris pH 8,5 100 mM EDTA 1 mM GSH 1,2 mM GSSG 0,12 mM isopropanol --- Qsp 25 % H2O Qsp 100 % 103

RESULTATS ET DISCUSSION

Figure 81 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif en présence d’isopropanol comme co-solvant (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Figure 82 – Cinétique du repliement oxydatif de la protéine AhPDF1 en fonction du co-solvant (isopropanol)

Contrairement à ce que l’on avait observé avec la protéine issue des bactéries, l’isopropanol comme co-solvant n’augmente pas la quantité de protéine repliée. Le rendement de la réaction de repliement oxydatif ne dépasse pas 40 % en présence de ce co-solvant (Figure 82). Pour la protéine AhPDF1 issue des bactéries, l’isopropanol aiderait à solubiliser d’autres protéines présentes malgré la purification. Ceci est confirmé par le fait que lors de la purification par HPLC sur une colonne semi-préparative C18, on rencontre de nombreux problèmes d’obstruction de la colonne qui vont jusqu’à devoir la régénérer. C’est pourquoi pour purifier la protéine d’E. coli, une colonne HPLC semi-préparative C8 est utilisée. De plus, durant le repliement de la protéine synthétique en présence d’isopropanol on observe un léger précipité.

Pour les prochains repliements oxydatifs, on n’utilisera donc pas de co-solvant.

RESULTATS ET DISCUSSION

III. 2) 3) Influence de la température

Tableau 12 – Conditions de repliement oxydatif de la protéine AhPDF1

Des essais de repliement ont été réalisés à 37, 45 et 60 °C. On observe une petite amélioration de la quantité de protéine repliée à 45 °C (rendement = 60 % en 2 h). Puis entre 45 °C et 60 °C il n’y a pas d’amélioration du repliement. C’est pourquoi on se place à 45 °C.

Figure 83 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif à 20 °C (température ambiante) (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Solution Concentration finale

AhPDF1 12 µM Tris pH 8,5 100 mM EDTA 1 mM GSH 1,2 mM GSSG 0,12 mM H2O Qsp 105

RESULTATS ET DISCUSSION

Figure 84 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif à 45 °C (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Figure 85 – Cinétique du repliement oxydatif de la protéine AhPDF1 en fonction de la température (20 °C et 45 °C)

L’augmentation de la température augmente la quantité de protéine repliée : 62% après 2 h à 45 °C contre 53% à température ambiante. La température active l’agitation moléculaire et augmente la vitesse de rappariement des cystéines au cours du repliement. Cependant après 6h de réaction à 45 °C on observe une diminution de la quantité de protéine, ce qui correspond à la précipitation de la protéine (Figure 85). C’est pourquoi il faut arrêter le repliement après 3 h-3 h

30 min.

RESULTATS ET DISCUSSION

III. 2) 4) Influence de la nature du premier résidu Gln ou pGln

Afin de tester si la nature du premier résidu a une influence sur le repliement oxydatif, nous choisissons de réaliser le repliement oxydatif à pH 7,5 et sans couple oxydo-réducteur. Nous avons vu précédemment qu’à ce pH, le repliement est lent, cela va nous permettre d’observer des différences, s’il y en a, entre les deux expériences.

Tableau 13 – Conditions de repliement oxydatif de la protéine AhPDF1

Figure 86 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif (sans couple oxydo-réducteur) avec une pyroglutamine comme premier résidu (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Figure 87 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif (sans couple oxydo-réducteur) avec une glutamine comme premier résidu (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Solution Concentration finale

AhPDF1 pGlu/Gln 25 µM Tris pH 7,5 100 mM EDTA 1 mM GSH --- GSSG --- H2O qsp 107

RESULTATS ET DISCUSSION A pH 7,5 le repliement de la protéine se fait lentement, on remarque que la quantité de protéine réduite pour les deux formes diminue entre le début de la réaction et 2 h. Pour la forme pyroglutamique, après 6 h, on n’observe plus de protéine réduite, mais une « bosse » correspondant à la protéine en cours de réarrangements (Figure 86). Après 6 h, il y a une petite quantité de protéine oxydée pyroglutamique présente.

Concernant la protéine glutamique, la forme réduite disparait après 2 h de réaction (Figure 87). De plus, après 6 h on observe la formation d’une plus grande quantité de protéine oxydée pyroglutamique et d’un peu de protéine oxydée glutamique.

On n’observe donc pas d’influence du premier résidu lors du repliement sans couple oxydo-réducteur. Nous réalisons à nouveau cette expérience mais en rajoutant le couple GSH/GSSG.

Tableau 14 – Conditions de repliement oxydatif de la protéine AhPDF1

Figure 88 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif (avec couple oxydo-réducteur GSSG/GSH) avec une pyroglutamine comme premier

résidu (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40 % d’acétonitrile/0,1 % TFA en 30 min)

Solution Concentration finale

AhPDF1 pGlu/Gln 25 µM Tris pH 7,5 100 mM EDTA 1 mM GSH 2,5 mM GSSG 0,25 mM H2O qsp OxpE Réd 108

RESULTATS ET DISCUSSION

Figure 89 – Suivi par chromatographie HPLC de la protéine AhPDF1 au cours du repliement

oxydatif (avec couple oxydo-réducteur GSSG/GSH) avec une glutamine comme premier résidu (Colonne C18 avec un gradient de 20 à 40% d’acétonitrile/0,1% TFA en 30 min)

Figure 900 – Cinétique du repliement oxydatif de la protéine AhPDF1 en fonction de la nature du premier résidu (pGlu et Gln). La quantité de protéine AhPDF1 oxydée à partir de Gln-AhPDF1

réduite, est calculée en ajoutant les deux formes oxydées Gln et pGlu.

Figure 911 – Quantité de protéine AhPDF1 pGlu et Gln oxydée obtenue au cours du repliement

oxydatif de la protéine Gln-AhPDF1 (calculée à partir de la Figure 89)

RESULTATS ET DISCUSSION On remarque qu’après 2 h, 24 % de la protéine AhPDF1 sous la forme Glutamine est repliée contre 38 % de protéine AhPDF1 sous la forme pyroglutamine (Figure 90). Après 6 h, on observe que la quantité de protéine AhPDF1 glutamique oxydée est de 32 % et de 38 % pour la protéine AhPDF1 pyroglutamique. La quantité de protéine oxydée glutamique augmente entre 2 h et 6 h alors que la quantité de protéine pyroglutamique reste constante. La glutamine se transforme en pyroglutamine au cours du temps (Dick et al., 2007), c’est pourquoi au cours du repliement on observe peu de protéine sous la forme glutamique (Figure 91). La différence entre les quantités de protéine repliée en fonction de la présence de la pyroglutamine n’est pas significative pour pouvoir conclure sur l’effet du premier résidu sur le repliement de la protéine AhPDF1.