Mise au point des conditions expérimentales

Le greffage de petites molécules organiques sur des biomolécules nécessite de nombreuses

optimisations, tant au niveau de la réaction de greffage proprement dite que pour les techniques

d’analyse du produit final. Il convient donc de décrire les différents éléments à considérer pour

réaliser et caractériser une réaction de bioconjugaison.

III.1.1.1 Méthode de greffage

Notons tout d’abord que toutes les biomolécules faisant l’objet d’études dans ce travail de thèse

sont utilisées en clinique. Il est donc nécessaire d’éliminer les différents excipients entrant dans la

formulation du médicament afin d’éviter la formation de produits secondaires. Chaque protéine a

par conséquent été purifiée par filtration centrifuge avant tout autre traitement.

Tous les greffages réalisés dans les sections suivantes ont été réalisés en milieu aqueux

tamponné. Dans la majorité des cas, la solution tampon utilisée est un tampon phosphate salin

(PBS) 0,1 M à pH = 7,4, et les réactions de bioconjugaison sont réalisées à 25 °C.

La majorité des réactions ont été réalisées sur le modèle décrit par De Vries et coll.

⁹⁶

Les

différentes molécules à greffer sont mises en suspension dans le chloroforme à des concentrations

définies, et la quantité désirée de suspension est ensuite placée dans un microtube en polypropylène.

Après évaporation du chloroforme, la solution de protéine est additionnée dans des quantités

prédéfinies, et le milieu réactionnel est agité sur agitateur orbital (vortex). La filtration centrifuge

s’est révélée une méthode simple et rapide de purification des produits par rapport à la dialyse.

Notre choix s’est porté sur des microfiltres centrifuges Nanosep

®

(Pall Corporation) avec différents

seuils de coupure suivant le poids moléculaire de la protéine à purifier. Tous les produits finaux ont

été conservés en solution dans le PBS à 4 °C.

III.1.1.2 Analyse des échantillons

Une analyse quantitative et qualitative des échantillons est un prérequis indispensable à la

réalisation d’expérimentations in vitro et in vivo. Les deux principales informations nécessaires sont

d’une part la concentration en protéine de la solution utilisée, et d’autre part le taux de greffage de

l’immunoconjugué.

III.1.1.2.1 Détermination de la concentration de la solution

La concentration en protéine d’une solution est généralement exprimée en mg.mL

-1

et peut être

déterminée de différentes manières. La majorité des méthodes de détermination de la concentration

en protéine sont des méthodes colorimétriques (méthodes de Bradford, de Lowry, etc.) et

nécessitent la réalisation de courbes d’étalonnage par spectrophotométrie UV-visible à l’aide d’une

solution de protéine à une concentration connue.

Il est également possible de déterminer la concentration de la solution par spectrophotométrie

UV-visible. L’absorbance maximale se situe à 280 nm, et si l’on dispose du coefficient d’extinction

molaire de la protéine, il est alors aisé de déterminer la concentration en protéine de la solution par

lecture de l’absorbance à 280 nm. Étant en possession de ces valeurs pour chacune des protéines

étudiées, nous avons choisi cette technique de détermination de la concentration pour toutes les

expériences décrites. La concentration de chaque solution a donc été déterminée avant et après

greffage, en considérant l’absorbance à 280 nm du fragment macrocyclique comme négligeable.

III.1.1.2.2 Détermination du taux de greffage

Nous avons choisi d’utiliser la spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser

Desorption Ionisation – Time Of Flight) comme outil de détermination du taux de greffage. Cette

méthode est en effet l’une des plus simple à mettre en œuvre, et présente l’avantage de ne nécessiter

qu’une très faible quantité de produit. Elle nécessite néanmoins de nombreuses optimisations, tant

au niveau des réglages de l’appareil que lors de la préparation de l’échantillon.

La source MALDI repose sur le bombardement à l’aide d’un laser d’une substance dispersée

dans une matrice solide. Cette matrice possède un fort pouvoir d’absorption du rayonnement, et

transfère l’énergie vers l’analyte afin de l’ioniser. Le choix de la matrice et la préparation du dépôt

sont deux éléments déterminants pour obtenir une bonne ionisation de l’analyte. Après de nombreux

tests de matrices (Figure III-1), et en se référant à la littérature,

212,213

l’acide sinapinique (SA) s’est

révélé la matrice permettant d’obtenir la meilleure détection et la meilleure résolution.

Figure III-1 : Représentation des différentes matrices testées pour l'analyse de protéines.

Il est à noter que la détermination du taux de greffage ne peut se faire que si la protéine de

référence a subi les mêmes opérations (changement de tampon, ajout d’un solvant organique…) que

l’échantillon à analyser. En effet, nous avons pu constater qu’un changement de tampon, ou la

présence d’un solvant organique tel que le DMSO lors de l’analyse d’un même composé conduit à

une variation de m/z pouvant aller jusqu’à 2000 unités de masse. Il est donc essentiel de pouvoir

garantir que la différence de masse observée est uniquement due au greffage de l’agent chélatant.

Le taux de greffage est alors obtenu par simple différence entre la masse de l’immunoconjugué et

celle de la protéine “native”.

III.1.1.3 Radiomarquage

III.1.1.3.1 Conditions opératoires

La manipulation de radionucléides nécessite la mise en œuvre de conditions opératoires

particulières. Toutes les expériences de radiométallation ont été réalisées derrière un écran plombé

ou dans une cellule blindée suivant les activités manipulées. Comme il a été évoqué précédemment,

nous avons choisi de réaliser les radiomarquages avec l’indium-111 afin de pouvoir réaliser par la

suite des études de biodistribution in vivo du radiotraceur par TEMP.

L’indium-111 (t

_1/2

= 67,3 h) est disponible commercialement sous forme de chlorure

d’indium-111 solubilisé dans une solution d’acide chlorhydrique (HCl 0,05 N). Notons que la préparation de

radioimmunconjugués ne nécessite que de faibles activités, et le radionucléide est donc présent à

l’état de trace. À titre d’exemple, une activité de 37 MBq d’indium-111 correspond à une quantité

OH HO O OH Acide 2,5-dihydroxybenzoique (DHB) HO O OH N N O OH _HO O OH O O Acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA)

Acide nicotinique Acide sinapinique (SA)

de 21,3 pmol. Dans ce contexte, il est primordial d’éviter toute contamination métallique qui

pourrait réduire de façon drastique le rendement de radiomarquage. Afin de minimiser ce risque,

toute la verrerie et tous les consommables plastique (pointes de micropipette, microtubes, etc.) ont

été traités à l’acide chlorhydrique 3 N puis rincés abondamment à l’eau ultra pure 18,2 MΩ avant

d’être séchés à l’étuve. Pour les mêmes raisons, les solutions tampons ont été préparées à partir de

sels exempts d’impuretés métalliques (Trace Select

®

) et d’eau ultra pure 18,2 MΩ.

Le fait de travailler avec des traces d’indium-111 implique d’utiliser un excès d’agents

chélatants par rapport au radionucléide. En effet, suivant l’application visée (tests in vitro, imagerie

in vivo), il n’est pas utile d’engager plus de radioactivité que nécessaire, tant pour des raisons

évidentes de radioprotection que pour des raisons de coût.

III.1.1.3.2 Contrôle qualité

Le contrôle de la pureté radiochimique est réalisé par radio-ITLC (Instant Thin Layer

Chromatography) grâce à un radiochromatographe γ. La phase stationnaire de chromatographie

consiste en un papier de microfibres de verre imprégné de gel de silice. L’utilisation d’une solution

de citrate de sodium à pH = 5 comme éluant permet de séparer l’indium-111 libre ou complexé à un

agent chélatant (DOTA, DTPA, EDTA) d’un anticorps radiomarqué. Dans ce système, le

radioimmunoconjugué reste au point de dépôt tandis que le radionucléide libre migre en front de

solvant. Le radiochromatographe permet ensuite de localiser la radioactivité sur toute la bande

chromatographique. Le chromatogramme obtenu permet ensuite de déterminer le rendement de

radiomarquage et la pureté radiochimique (PRC) par intégration des différents pics présents (Figure

III-2).

Figure III-2 : Radiochromatogrammes ITLC d’un anticorps radiomarqué (gauche)

et de l’indium-111 libre (droite).

Dans le document Marquage de molécules biologiques par des complexes de radiométaux à base de polyamines macrocycliques (Page 86-90)