Microscopie corrélative à l’échelle de la cellule unique

Lors de cette étude, nous avons eu l’occasion de mettre en œuvre un développement original impliquant les techniques de microscopies conventionnelles telles que la microscopie à épi-fluorescence et la microscopie électronique à balayage à la microanalyse par faisceau d’ions. Ce type de microscopie corrélative peu répandue permet d’aller de l’analyse in vitro classique vers une analyse complète de la topographie des cellules ainsi que de l’analyse élémentaire in situ avec quantification, le tout sur une même zone d’intérêt.

Si la toxicité des NPs de TiO2 est dose-dépendante, il est essentiel de pouvoir les quantifier à l’échelle cellulaire. La fluorescence permet de localiser les NPs dans les compartiments cellulaires. Elle permet même dans certains cas leur quantification [9, 10]. La quantification requiert cependant l’utilisation d’étalons et peut être faussée par un taux de greffage variable en surface des particules, par l’agrégation des NPs ou même par des phénomènes de photo-bleaching (photo-blanchiment) [7]. De plus, la modification de surface subie par les NPs peut également influer sur leur toxicité ainsi que sur leur comportement vis-à-vis des organismes biologiques. En conséquence, les expériences réalisées avec ces NPs

fonctionnalisées ne donneront pas une idée exacte du comportement toxique de la NP native en elle-même.

Il est donc crucial de mettre au point des techniques qui permettent la localisation et la quantification de ces dernières sans avoir recours à la modification de surface. L’IBA et la MEB sont des techniques puissantes pour l’analyse chimique in situ et l’observation de la topographie des échantillons et sont là pour répondre à ces requis. Elles permettent l’observation des NPs natives mais ne sont pas adaptées à l’observation in vitro / in vivo. Ainsi, pour répondre à cette problématique, il faut corréler toutes ces techniques et les appliquer sur un même échantillon de cellules exposées à des NPs fonctionnalisées pour prouver le concept puis étendre l’ensemble à des NPs natives.

Le but de ce travail fut donc de combiner ces différentes méthodes d’analyse pour valider les observations et obtenir une vue d’ensemble d’un échantillon avec de l’imagerie classique, de l’imagerie haute résolution avec la MEB et de l’imagerie chimique et quantitative avec l’IBA.

Les échantillons ont été cultivés sur des puits PEEK recouverts de polycarbonate et exposées aux NPs fonctionnalisées pendant 24 h. Le design de ce porte échantillon est essentiel puisqu’il doit (i) être compatible avec toutes les techniques d’analyse envisagées (ii) permettre la cryofixation / lyophilisation (iii) permettre la traçabilité et la relocalisation aisée (dans le plan (x, y)) sous le faisceau (lumineux, électronique ou ionique) d’une cellule donnée entre deux techniques d’analyse. Les noyaux des cellules ont ensuite été marqués au Hoechst³³³⁴² et l’appareil de Golgi à la GFP puis les cellules ont été observées vivantes et fixées en microscopie à épi-fluorescence.

La première phase de ce travail est montrée sur la Figure 11. L’image de microscopie à épi-fluorescence in vitro (a) est comparée avec l’image après fixation (b). Comme précédemment présenté, les NPs sont localisées autour du noyau à proximité de l’appareil de Golgi [2]. Après fixation, les marquages fluorescents ont été altérés. Il est possible de voir que le signal de fluorescence est plus diffus et que la contribution de la GFP a disparu. Cette disparition est fréquemment rapportée pour les marqueurs organiques ou les protéines fluorescentes lorsque du passage d’un milieu aqueux vers un solvant organique ou un environnement déshydraté [11].

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Chapitre 4 : Interactions des nanoparticules de TiO2 avec les cellules

Références bibliographiques p. 184 173

pointent des zones légèrement plus brillantes qui indiquent la présence d’objets plus denses que la cellule. L’analyse EDX valide qu’il s’agit de titane et donc de NPs.

Figure 13 : Clichés de MEB (électrons rétrodiffusés) a) du groupe de cellules et b) de la cellule centrale zoomée. c) et d) montrent respectivement les analyses EDX du phosphore et du titane de la cellule (échelle 40 µm et 10 µm).

La comparaison entre la MO, l’IBA et le MEB-EDX montre qu’il est possible d’observer un même échantillon par différentes techniques d’analyse complémentaires. Le premier avantage de ce type de microscopie corrélative est la concordance des observations. Celle-ci permet ainsi de valider toutes les observations réalisées avec les NPs fluorescentes et de les transposer aux NPs natives utilisées pour l’analyse toxicologique.

Le développement en routine de ce type de microscopie corrélative, avec la possibilité de fixer les échantillons à n’importe-quel moment, permet également d’aller plus loin et de

réaliser des analyses dynamiques. Il est ainsi possible de suivre des évènements biologiques in vivo / in vitro et de les caractériser ensuite plus finement à un instant donné à l’aide de la quantification. Par exemple, il est possible de suivre l’internalisation des NPs dans les

cellules ou encore l’impact de leur présence sur le taux de calcium intracellulaire comme dans les précédents travaux rapportés par le groupe [2].