Durant cette thèse nous avons effectué des manipulations en collaboration avec l’équipe d’Eric LeCam à l’institut Gustave Roussy (IGR) à Villejuif. Cette équipe est spécialisée dans les observations de microscopie électronique. Une présentation rapide de leur technique est présenté dans cette section.
Microscopie électronique 43
Pince magnétique Piège Optique
Avantages Force constante (10−14-10−11 N) Force élevée (10−13-10−10 N) Torsion de la molécule possible Déplacement imposé (Force
variable en fonction de l’étirement de la molécule) Calibration de force directe,
mais longue
Pour travailler à force constante, nécessite d’avoir une boucle de rétroaction Inconvénients Limités à des basses forces Calibration indirecte
Pas de mesure du couple Possibilité d’endommagement des biomolécules
Tableau 2.1 - Avantages et inconvénients des montages de piège optique et de pince magnétique
2.4.1
Préparation des grilles de microscopie
Les complexes nucléoprotéiques sont formés dans les conditions précisées plus loin pour chaque expérience et sont étalés sur une grille en cuivre recouverte d’une fine couche de carbone fonctionnalisée.
Les grilles de microscopie sont faites d’un maillage de cuivre formant des alvéoles (carrées ou hexagonales) plus ou moins grandes. Les grilles utilisées contiennent environ 200 alvéoles d’environ 42 µm de longueur.
Le film de carbone qui constitue le support d’observation sur lequel les molécules s’adsorbent est préparé en appliquant un courant de haute intensité à une tresse de carbone maintenue sous vide au-dessus d’un feuillet de mica fraîchement clivé. Cela provoque la vaporisation du carbone sur la surface du mica en un film de plusieurs dizaines à quelques centaines d’Angströms. Ce film de carbone est alors décollé de la surface du mica et déposé à la surface de la grille de microscopie. On procède alors à la fonctionnalisation de cette surface.
Pour l’adsorption de l’ADN et des complexes ADN-protéine et leur observation en coloration positive, on réalise une ionisation en présence de pentylamine3 dans une
enceinte maintenue sous-vide [33].
2.4.2
Mise en place d’une expérience
Une goutte (5 µL) de la solution contenant les complexes à étudier est déposée à la surface de la grille pendant 60 secondes. On ajoute ensuite une goutte d’une solution d’acétate d’uranyle4 qui agit comme un agent contrastant en réagissant avec l’ADN. Il s’agit donc d’une coloration positive. On élimine l’excès de colorant à l’aide d’un papier
3de formule chimique CH3(CH2)4NH2
filtre.
Le microscope électronique est un Leo Zeiss 902. Le mode d’imagerie est le mode fond noir annulaire filtré. La source électronique est un filament de tungstène. Une ten- sion de 80 kV est appliquée entre les électrodes émettrices. Le premier diaphragme est annulaire et permet de sélectionner les électrons émis aux grands angles, qui sont focali- sés au niveau de l’objet. Un autre diaphragme permet de sélectionner le centre du cliché de diffraction, où se trouve le maximum d’information. Un filtre spectroscopique per- met de sélectionner les électrons élastiques et d’éliminer les électrons inélastiques pour une amélioration du contraste [26]. L’image impressionne un film négatif argentique qui est ensuite révélé et numérisé. Les images sont ensuite traitées numériquement
2.4.3
Avantages et inconvénients de la technique utilisée
La technique de dépôt des échantillons sur la surface de la grille ne fait pas appel à la fixation chimique. Les complexes nucléoprotéiques sont adsorbés à la surface de la grille en conservant les informations structurales de l’interaction (par opposition à une projection 3D-2D) [68]. Cette technique a permis de mettre en évidence que les paramètres conformationnels de la molécule d’ADN sont conservés [48,60,122].
Par contre cette technique empêche l’utilisation de fortes concentrations d’ATP, car cette molécule réagit avec l’acétate d’uranyle, ce qui qui limite la qualité de la visualisation. De plus les manipulations à hautes concentrations en protéines (au delà de 100 nM) rendent également les observations difficiles, car les protéines libres se fixent à la surface et rendent difficile la visualisation. Toutefois des manipulations à hautes concentrations en ATP ou en protéine peuvent être réalisées mais elles nécessitent une filtration sur colonne afin d’éliminer les molécules libres ou les protéines libres. Mais cette technique de filtration rajoute une étape et peut éliminer des complexes, ce qui la rend plus difficile à exploiter.
Chapitre 3
Étude de MutS à l’échelle de la
molécule unique
« N’entretiens pas l’espoir de ce qui ne peut être espéré. »
Pythagore
Afin de déterminer le mode d’action de MutS en présence d’un mésappariement (cf section1.9), nous avons utilisé la pince magnétique. Cette outil nous permet de suivre en temps réel l’extension d’une molécule d’ADN contenant ou pas un mésappariement en son centre. Cette molécule est arrimée entre une bille microscopique et une surface de verre (cf section 2.1). Nous pouvons aussi obtenir une estimation de la raideur de cette même molécule, à l’aide des courbes de force-extension et en utilisant le modèle du ver (la sectionA.1.3 rappelle les propriétés mécanique de l’ADN). Nous avons donc un outil pour déterminer quel est le mode d’action de MutS. Les expériences présentées dans cette partie on été effectuées avec Camille Brème.
3.1
Constructions d’ADN
Nous avons utilisé durant ces expériences deux types de constructions : une conte- nant un mésappariement, et une n’en contenant pas. Ainsi à l’aide de ces deux construc- tions nous pouvons distinguer les effets spécifiques (c’est-à-dire en présence d’un mésap- pariement) et non spécifiques (c’est-à-dire en l’absence d’un mésappariement).
Ces deux constructions ont une architecture similaire : une extrémité de la construc- tion porte des ligands biotines et l’autre extrémité des ligands digoxygénines.
Les deux molécules sont construites à partir d’un plasmide de 7,5 kb (cf annexe X pour les détails de préparation).