Techniques en microscopie Résumé
6.3 Microscope électronique
http://en.wikipedia.org/wiki/Electron_microscopy
Le microscope électronique utilise des électrons pour créer une image de l’échan-tillon. Il possède une résolution de loin supérieure au microscope optique, jusqu’à 2 000 000 x, ce qui nous permet de voir de petits objets et des détails.
6.3.1 Microscope électronique à transmission (MET)
Forme d’origine du microscope électronique, il comprend une cathode qui émet un faisceau électronique ainsi que des lentilles magnétiques. Le faisceau, qui est partiellement transmis à travers un échantillon très mince et semi-transparent, transporte des informations sur la structure de celui-ci. La variation spatiale de ces informations (l’image) est agrandie par une série de lentilles magnétiques MXVTX¶jFHTX¶HOOHVRLWHQUHJLVWUpHDXFRQWDFWG¶XQpFUDQÀXRUHVFHQWG¶XQSOD -teau photographique ou d’un détecteur photosensible comme la caméra CCD. /¶LPDJHGpWHFWpHSDUFHWWHGHUQLqUHV¶DI¿FKHHQVXLWHVXUXQPRQLWHXURXXQpFUDQ d’ordinateur.
Le MET à haute résolution (METHR) se voit limité par des aberrations sphériques et chromatiques, mais une nouvelle génération de correcteurs arrive à en venir à bout. La correction par logiciel de ces déformations a réussi à produire des images montrant des atomes de carbone séparé de diamant par seulement 0.89 ångström (89 picomètres) et des atomes séparés de la silicone par 0.78 ångström (78 picomètres), tout cela grâce à un grossissement de 50 000 000 x. La capacité de situer des atomes à l’intérieur de structures a fait du METHR un outil indis-pensable en recherche et progrès de la nanotechnologie et d’autres domaines, incluant la catalyse hétérogène et la conception d’appareils semi-conducteurs électroniques et photoniques.
6.3.2 Microscope électronique à balayage (MEB)
Contrairement au MET, qui détecte les électrons par la transmission d’un fais-ceau, le MEB produit une image à partir des électrons secondaires qui s’agitent à la surface à cause de l’excitation du rayon d’électrons primaires. Le faisceau GX0(%¿OWUHjWUDYHUVO¶pFKDQWLOORQHWOHVGpWHFWHXUVIRUPHQWXQHLPDJHjSDUWLU des signaux détectés et de la position du faisceau.
En général, la résolution du MET surpasse celle du MEB d’environ un ordre de grandeur; toutefois, parce que le MEB travaille horizontalement plutôt que verticalement, il arrive à produire une image vaste et précise qui représente plus ¿GqOHPHQWODVWUXFWXUH'GHO¶pFKDQWLOORQ
6.3.3 Microscope électronique à réflexion
Comme le MET, il tient compte de l’incidence des faisceaux électroniques à la surface, mais plutôt que d’utiliser la transmission (MET) ou les électrons secon-GDLUHV0(%F¶HVWODUpÀH[LRQGXIDLVFHDXTXLHVWGpWHFWpH7\SLTXHPHQWFHWWH WHFKQLTXHHVWMXPHOpHDYHFODGLIIUDFWLRQUpÀH[LRQG¶pOHFWURQVGHKDXWHpQHUJLH HWODUpÀH[LRQGXVSHFWUHGHSHUWHGHKDXWHpQHUJLH563+(/DPLFURVFRSLH électronique polarisée par rotation de basse énergie (MEPRBE) constitue une variation utilisée dans l’observation de microstructure de régions magnétiques. Avant d’être examinés au microscope, les échantillons nécessitent peut-être un traitement pour être adéquats. La technique à utiliser dépend de l’échantillon et de l’analyse désirée.
&U\R¿[DWLRQ– Geler un échantillon si rapidement, aux températures du nitrogène ou de l’hélium liquides, que l’eau se change en glace vitreuse (et non cristalline). Cela permet d’immortaliser le spécimen en son statut de solution. Cette technique a donné naissance au domaine de la microscopie cryo-électrique; grâce à l’avan-cement de cette dernière, il est maintenant possible d’observer presque n’importe quel échantillon dans un état quasi natif.
Fixation – Préserver l’échantillon pour lui donner une allure réaliste. Le gluta-raldéhyde le durcit, alors que le tétroxide d’osmium noircit les lipides.
Déshydratation – Remplacer l’eau par des solvants organiques tels que l’éthanol ou l’acétone.
Enrobage±,Q¿OWUHUOHWLVVXDYHFGHODUpVLQHFRPPHO¶DUDOGLWHRXODUpVLQH époxyde) avant de disséquer.
Dissection – Elle produit de très minces couches d’échantillons qui laissent passer les électrons et peut se faire sur un ultramicrotome, à l’aide d’un diamant de coupe. Le couteau de verre, qui peut être fabriqué en laboratoire et qui est meilleur marché, est aussi utilisé.
Coloration ±¬O¶DLGHGHPpWDX[ORXUGVWHOVTXHOHSODFHUO¶XUDQLXPHWOHWXQJV -WqQHRQGLVSHUVHOHVpOHFWURQVD¿QGHFUpHUXQFRQWUDVWHHQWUHOHVVWUXFWXUHVpWDQW donné que beaucoup de matériaux (surtout biologiques) sont « transparents » face aux électrons. En biologie, les échantillons sont normalement colorés « en bloc » avant d’être enrobés et colorés tout de suite après avoir été brièvement exposés à une solution aqueuse (ou contenant de l’alcool) de métaux lourds.
Cryofracture ou cryodécapage – Une méthode de préparation utile pour exa-miner des membranes lipidiques et leurs protéines intégrées « de front ». Le tissu IUDLVRXOHVFHOOXOHVHQVXVSHQVLRQVRQWUDSLGHPHQWJHOpVSDUFU\R¿[DWLRQSXLV EULVpVDYHFXQPLFURWRPHjODWHPSpUDWXUHGXQLWURJqQHOLTXLGH¬O¶LQWpULHXU d’une enceinte à vide poussé, on vaporise à un angle moyen de 45° de la platine ou de l’or sur la surface froide et fracturée (parfois gravée par une augmentation GHODWHPSpUDWXUHj&SHQGDQWSOXVLHXUVPLQXWHVD¿QTXHODJODFHSXLVVHVH sublimer). Souvent, on vaporise une seconde couche de carbone perpendiculai-rement à la surface ordinaire dans le but d’augmenter la stabilité de la réplique. On ramène l’échantillon à température et pression de la pièce. Par la suite, la très fragile réplique de la surface fracturée se voit libérée du matériel biologique sur lequel elle repose, digérée par des acides, une solution hypochlorite ou encore XQGpWHUJHQW6'6/DUpSOLTXHTXLÀRWWHWRXMRXUVHVWHQVXLWHQHWWR\pHGHWRXV résidus de produits chimiques, repêchée sur des grilles EM, séchée puis observés au MET.
Moulage de faisceau d’ions – amincit les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient transparents aux électrons. De manière inclinée, on crible des ions (d’argon, surtout) et projette des matériaux à la surface. Ce processus comporte une sous-classe, le moulage concentré de faisceau d’ions, dans lequel on utilise le gallium pour former une membrane électronique transparente dans une région particu-lière de l’échantillon (dans le dispositif d’un microprocesseur, par exemple). Avant l’examen d’échantillons au MEB, on l’utilise aussi dans le polissage de FRXSHVWUDQVYHUVDOHVSDUFHTXHOHSROLVVDJHPpFDQLTXHHVWSDUIRLVWURSGLI¿FLOH à effectuer.
Enduit conducteur – Une très mince couche de matériaux conducteurs d’élec-trons qui est déposée par vaporisation à haute pression ou par projection à faible pression. Cette technique fait en sorte que des champs d’électricité statique ne se forment pas autour de l’échantillon à cause de l’irradiation d’électrons nécessaire
à l’imagerie. Parmi les matériaux utilisés, tous aussi importants dans l’étude d’échantillons avec le microscope à balayage, on compte l’or, le palladium, la platine, le tungstène, le graphite, etc.