Microbiologie de l'argile à Opalinus et du Callovo-Oxfordien

Par opposition aux aquifères, l'argile à Opalinus et l'argilite du Callovo-Oxfordien sont des

aquitards, c'est-à-dire des formations géologiques à faible potentiel de circulation et de stockage

d'eau. Ces milieux sont donc a priori beaucoup moins favorables au développement et à la survie de

microorganismes. Du point de vue microbiologique, ces sédiments argileux ont uniquement fait

l'objet d'études préliminaires ou d'observations signalant une activité microbienne perturbatrice de

mesures géochimiques ou de caractérisations minéralogiques.

Au début de cette thèse, une estimation de la biomasse et de la biodiversité microbiologique

dans l'argile à Opalinus avait été réalisée par extraction, quantification et caractérisation des acides

gras polaires (PLFA) contenus dans des échantillons de 500 g d'argile. D'après la composition observée

en phospholipides, ces travaux indiquaient que des bactéries Gram-négatives anaérobies étaient

majoritairement présentes, et que la communauté microbienne pouvait également inclure des

champignons. En outre, l'application d'un taux de conversion précédemment décrit pour des

environnements de subsurface [Balkwill et al., 1988] permettait d'estimer la concentration

microbienne autochtone à une valeur comprise entre 106 à 108 cellules par gramme d'argile à

Opalinus [Mauclaire et al., 2002]. Les mêmes expériences menées plus récemment avec davantage

de précautions vis-à-vis des risques de contaminations extérieures ont confirmé ces résultats, avec

toutefois une concentration microbienne réduite à une valeur proche de 5·106 bactéries par gramme

de sédiment [Stroes-Gascoyne et al., 2004].

Aucune étude portant sur la caractérisation de la flore microbienne autochtone de l'argilite

du Callovo-Oxfordien de Meuse/Haute-Marne n'avait en revanche été menée au début de nos travaux

en 2003. Toutefois, des signes de présence microbiologique ont pu être mis en évidence au cours

d'expériences de géochimie et d'hydrogéologie réalisées ces dernières années.

La caractérisation minéralogique de l'argilite du Callovo-Oxfordien a conduit à la visualisation

de pyritosphères au voisinage desquelles se concentre de la matière organique, constituant des

traces d'une intense activité bactérienne productrice de sulfures antérieure à la compaction de la

formation géologique [Gaucher et al., 2004a]. Cependant, les analyses isotopiques du CO2 et du

méthane contenus dans l'argilite indiquent que ces gaz sont d'origine inorganique, et suggèrent donc

l'absence d'une activité biologique productrice de gaz à l'époque actuelle [Girard et al., 2005].

Si aucun signe de vie actuelle n'a été observé dans le Callovo-Oxfordien, la présence de

bactéries chimiolithotrophes autotrophes anaérobies a précédemment été évoquée dans des eaux

géothermales des formations sous-jacentes du Dogger et du Trias du Bassin de Paris, à une

profondeur de 1900 m et à une température d'environ 70°C [Daumas et al., 1986].

Plus récemment, la série d'expériences PAC (Prélèvements et Analyses Chimiques) a été

initiée dans le Callovo-Oxfordien au laboratoire souterrain de Meuse/Haute-Marne [Vinsot et Mettler,

2005]. Parmi celles-ci, l'expérience PAC2001 reposait sur un équilibrage d'eau synthétique de

composition connue avec l'eau interstitielle du Callovo-Oxfordien dans le but de déterminer sa

composition chimique. Pour cela, l'eau synthétique est mise en circulation au sein d'un circuit fermé,

sous gaz neutre, pendant plusieurs semaines à plusieurs mois. Ce circuit passe dans un intervalle de

test défini au sein d'un forage, au niveau duquel se produit l'équilibrage entre les deux eaux (Figure

9). En dépit des précautions prises pour limiter la contamination microbiologique (nettoyage du

module de circulation d'eau à l’alcool et séchage sous flux d’azote, stérilisation de l'eau synthétique

à l'autoclave), une diminution de la concentration en sulfate, concomitante à l'apparition de sulfure

et à une augmentation de l'alcalinité, a été observée tout au long de l'expérience (Figure 10). Elle a

été attribuée à une croissance microbiologique impliquant des bactéries sulfato-réductrices (BSR).

Figure 9. Schéma du montage expérimental de circulation d'eau en forage réalisé au cours

de l'expérience PAC2001. La ligne dans laquelle se fait la circulation d'eau est figurée en

bleu foncé. Dans le module de circulation, des circuits parallèles comportant des cellules

amovibles permettent d'effectuer des prélèvements d'eau de 25 et 40 mL sans perturber le

circuit principal. D'après Vinsot et Mettler, 2005.

Figure 10. Profils de composition chimique des échantillons d'eau prélevés au cours de

l'expérience PAC2001. Les valeurs indiquées en ordonnée sont exprimées en mol·L-1 pour Na,

K, Mg, Ca, Sr, Cl et sulfate, et en Eq·L-1 pour l’alcalinité. La diminution de la concentration

en sulfate et l'augmentation de l'alcalinité dans les échantillons prélevés, par rapport à

l'eau synthétique injectée initialement et au modèle de composition chimique de l'eau

interstitielle, indiquent le développement de bactéries sulfato-réductrices dans le volume

d'eau en circulation. D'après Vinsot et Mettler, 2005.

Un suivi microbiologique, basé sur l'inoculation d'échantillons d'eau dans différents milieux

de culture et réalisé tout au long de l'expérience (Tableau 1), a confirmé ce développement

microbiologique, également à l'origine de la perturbation des mesures de pH et des concentrations

en strontium, calcium et magnésium [Vinsot et Mettler, 2005]. Au cours de cette expérience, des

ruptures de ligne sont survenues à plusieurs reprises sur le montage expérimental, nécessitant la

remise en eau complète ou partielle du circuit. Ces incidents sont probablement à l'origine de

l'introduction de microorganismes dans les volumes d'eau mis en circulation. Toutefois les BSR sont

des organismes anaérobies stricts et sont, comme nous l'avons vu, susceptibles d'exister dans les

environnements sédimentaires de subsurface.

L'expérience PAC2002 consistait quant à elle à collecter de l'eau naturellement relâchée par

la formation argileuse dans un forage placé sous circulation d'azote. La présence de bactéries

réductrices de sulfate a été mise en évidence de la même manière qu'au cours de l'expérience

PAC2001, cette fois sans rupture de ligne. L'analyse des profils de composition chimique obtenus a

également indiqué une diminution de la concentration en sulfate et une perturbation de l'alcalinité.

Mise en eau 1 2 3

Echantillon

EST01702

EST01703 ^{EST01717 EST02074 EST02075 EST02077 EST02078 EST01721 EST01722}

Eau

initiale ^{Eau forage Eau forage Eau forage Eau forage Eau forage Eau forage Eau forage}

Date 01/02/2005 29/03/2005 25/05/2005 26/05/2005 26/05/2005 01/06/2005 07/07/2005 07/07/2005

Jours écoulés 0 56 113 0 0 6 42 0

Bactéries

aéro-anaérobies

25

<0,5

<0,5 ^{250 2,5 25 6.10}

3 2,5.104 n.a. 2,5

Bactéries

sulfato-réductrices

<0,5

<0,5

<0,5 ^6.10

3 >106 <0,5 25 2,5.103 n.a. 2,5

Bactéries

thiosulfato-réductrices

<0,5

<0,5

<0,5 ^{50 25 <0,5 <0,5 <0,5 n.a. <0,5}

Bactéries

méthanogènes

<0,5

<0,5

<0,5 ^{<0,5 n.r. n.r. n.r. n.r. n.a. n.r.}

Bactéries

réductrices de

fer

<0,5

<0,5

<0,5 ^{<0,5 n.r. n.r. n.r. n.r. n.a. n.r.}

Tableau 1. Suivi microbiologique réalisé au cours de l'expérience PAC2001 par la société

CFG-Services/BRGM. Les concentrations bactériennes sont exprimées en bactéries·mL-1 d'eau prélevée.

Trois échantillons d'eau synthétique initiale ont été analysés. Trois mises en eau du circuit

expérimental ont été réalisées suite à des incidents de rupture de ligne. (n.a.), non analysé: perte

d'échantillon. (n.r.), non recherché. D'après Vinsot et Mettler, 2005.

Au cours d'expériences de ce type, il est raisonnable de penser que des microorganismes sont

inévitablement introduits dans le circuit expérimental, au cours de son montage ou au gré

d'incidents de rupture de ligne, et ceci en dépit des quelques précautions prises vis-à-vis du risque

de contamination microbiologique. Dès lors, si les conditions sont favorables au développement de

ces cellules, on observe une perturbation des mesures de certains paramètres effectuées sur la

ligne de circulation. Toutefois, une partie des microorganismes détectés au cours de ces

expériences pourraient avoir une origine autochtone. En effet, un apport très faible d’espace,

d’eau et de nutriments peut suffire à réactiver des bactéries à faible activité métabolique ou en

quiescence. Des microorganismes pourraient donc être réactivés suite aux perturbations des

argiles générées par les forages et le creusement des galeries.

Compte-tenu de l'entrée en jeu d'une composante microbiologique dans les paramètres

influençant les études géochimiques menées sur le site de Meuse/Haute-Marne, une partie de ce

travail de thèse a consisté à procéder à des analyses microbiologiques sur un échantillon prélevé

au cours de l'expérience PAC2001, dans la continuité des prélèvements déjà effectués, pour

tenter de caractériser les espèces microbiennes capables de se multiplier dans le volume d'eau en

circulation. Puis il nous a également été proposé d'assurer le suivi microbiologique des

expériences DIR1001, DIR1002 et DIR1003 dédiées à l'étude du comportement diffusif de traceurs

radioactifs dans l'argilite du Callovo-Oxfordien. Les expériences DIR sont de la même façon basées

sur un équilibrage préalable d'eau synthétique avec l'eau interstitielle avant injection du mélange

de traceurs, et reposent sur le même type de montage expérimental que l'expérience PAC2001

[Dewonck, 2005].

Dans le document Caractérisation microbiologique de l'argile à Opalinus du Mont Terri et de l'argilite du Callovo-Oxfordien de Meuse/Haute-Marne (Page 45-49)