CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
3. METHODES
3.1. Population d’étude
Elle a été constituée de 34 enfants de 0 à 5 ans sans distinction de sexe.
3.1.1. Critère d’inclusion
Tout enfant âgé de 0 à 5 ans admis dans les cliniques sélectionnées pour raison de gastroentérites faites de diarrhées, avec ou sans vomissements comme premier motif de consultations.
3.1.2. Critère de non inclusion
Tout enfant âgé de 0 à 5 ans présentant des selles sanguinolentes.
3.2. Prélèvement
Les échantillons de selles ont été prélevés 48 heures au plus tard après l’admission à l’hôpital des enfants pour éviter les infections nosocomiales, dans des pots propres en plastique de 25 ml. Ces échantillons ont ensuite été transportés au laboratoire national de santé pour analyses dans une glacière contenant des accumulateurs de froid.
3.3. Recherche de l’antigène VP6
La détermination de la protéine VP6 a été réalisée par la technique ELISA, selon la méthode décrite dans le kit ProSpecT Rotavirus.
Les différents réactifs du kit ProSpecT rotavirus et les échantillons de selles à tester ont été sortis du réfrigérateur 30 minutes avant la manipulation. Une suspension à 10% a été préparée en ajoutant 100 μL de selles liquides ou 0,1 g de selles solides soit environ la taille d’un petit pois à 900 μL du diluant fourni avec le kit. La suspension a été mélangée à l’agitateur vortex pendant 30 secondes, puis centrifugée à 5000 tours/minute pendant 3 minutes.
Un volume de 100 μL de surnageant de chaque échantillon dilué a été ajouté aux différents micropuits suivant une feuille de paillasse pré établie. Un contrôle positif et un contrôle négatif ont toujours été inclus dans chaque série de tests.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 1818
Ensuite, 100 μL soit deux gouttes du conjugué ont été ajoutés dans chaque micropuits. Le conjugué contient des anticorps polyclonaux spécifiques à la protéine VP6 et le conjugué à de la peroxydase. La plaque a été recouverte et incubée à 22°C pendant 60 +/- 5minutes. Après incubation, le contenu des micropuits a été déversé où chaque micropuits a été lavé avec une solution tampon de lavage préalablement diluée au 1/10. Ce processus de lavage a été réalisé 5 fois au total. Après le lavage final, la plaque a été renversée et tapotée sur du papier absorbant pour retirer les dernières traces de tampon de lavage.
Après ce lavage, 100 μL de substrat ont été ajoutés dans chaque micropuits. Le substrat est un chromogène qui permet de révéler la réaction. Les micropuits ont été ensuite incubés à 22°C pendant 10 minutes, et reçoivent 100 μL de solution d’arrêt. La lecture au spectrophotomètre a été effectuée dans les 30 minutes qui ont suivi l’ajout de la solution d’arrêt.
La lecture a été faite à partir d’un lecteur ELISA en double longueurs d’onde 450 et 650 nm. La propreté du fond des micropuits a été soigneusement vérifiée avant la lecture.
Le calcul de la valeur seuil ou le « Cut-off value » a été fait en ajoutant 0,200 unités d’absorbance à la valeur du contrôle négatif, selon les recommandations du fabricant et approuvées par les laboratoires de références de l’OMS.
Le test a été validé si la valeur du contrôle négatif est strictement inférieure à 0,150 unités d’absorbance et celle du contrôle positif, strictement supérieure à 0,500 unités d’absorbance.
A l’issu de la lecture, tout échantillon des selles dont la valeur d’unité d’absorbance est supérieure à la valeur seuil est positif, et tout échantillon des selles dont la valeur d’unité d’absorbance est inférieure à la valeur seuil est déclaré négatif.
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Les échantillons dont les résultats ont donné des valeurs d’unités d’absorbance se situant à moins de 0,010 unités d’absorbance de la valeur seuil ont été considérés comme équivoque. Ces échantillons ont été à nouveau testés, ou le patient a été soumis à de nouveaux prélèvements.
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CHAPITRE III
RESULTATS ET COMMENTAIRES
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1.RESULTATS
1.1. Caractéristiques épidémiologiques de la population d’étude.
Tableau I : Répartition de la population d’étude selon l’âge et le sexe.
Tranches d’âges
Sexe
M F
N (%) N (%)
Effectif N %
≤ 6 mois 10 (29 ,41) 02 (5,88) 12 (35,29)
7 – 12 mois 04 (11,76) 04 (11,76) 08 (23,53)
12 – 19 mois 02 (5,88) 00 (00) 02 (5,88))
19 – 24 mois 06 (17,65) 02 (5,88) 08 (23,53)
≥ 25 mois 02 (5,88) 02 (5,88) 04 (11,76)
Total 24 (70,59) 10 (29,41) 34 (100)
M : Masculin F : Féminin Les enfants âgés de moins de 06 mois sont les plus représentés (35,29%) suivis des enfants âgés de 7 à 12 mois (23,53%). Le sex-ratio est de 2,4 en faveur des garçons.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2222
1.2. Répartition de la population d’étude en fonction de l’hospitalisation de l’état de déshydratation, de la fièvre, du vomissement.
Tableau II : Répartition de la population selon l’hospitalisation.
Hospitalisation
Sexe M F
N (%) N (%)
Effectif N (%)
Oui 12 (35 ;29) 04 (11,76) 16 (47,05)
Non 12 (35,29) 06 (17,65) 18 (52,94)
Total 24 (70,59) 10 (29,41) 34 (100)
M :Masculin F : Féminin
Les enfants hospitalisés constituent 47,05% (16/34) de l’effectif.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2323
Tableau III : Répartition de la population d’étude selon l’état de déshydratation.
Déshydratation
Sexe
M F
N (%) N (%)
Effectif N %
Sévère 04 (11,76) 00 (00) 04 (11,76) Evident 02 (5,88) 08 (23,53) 10 (29,41)
Aucune 18 (52,94) 02 (5,88) 20 (58,82)
Total 24 (70,59) 10 (29,41) 34 (100)
M :Masculin F : Féminin L’état de déshydratation sévère a été observé chez 11,76% (4/34) enfants.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2424
Tableau IV : Répartition de la population d’étude selon la présence de fièvre.
Fièvre
Sexe
M F
N (%) N (%)
Effectif N (%)
Oui 10 (29,41) 04 (11,76) 14 (41,18) Non 14 (41,18) 06 (17,65) 20 ( 58,82)
Total 24 ( 70,59) 10 (29,41) 34 (100)
M : Masculin F : Féminin
Dans la population d’étude, 41,18% (14/34) des enfants ont présenté une fièvre. Ont été considérés fiévreux, tout enfant dont la température est supérieure à 37,5° (Présence de fièvre = T° > 37,5°).
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2525
Tableau V : Répartition de la population d’étude selon la présence de vomissement.
Vomissement
Sexe
M F
N (%) N (%)
Effectif
N (%) Oui 14 (41,18) 08 (23,53) 22 (64,71) Non 10 (29,41) 02 (5,88) 12 (35,29) Total 24 (70,59) 10 (29,41) 34 (100)
M : Masculin F : Féminin
Environ 2/3 (64,71%) de la population d’étude avaient un problème de vomissement.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2626
1.3. Prévalence de l’infection à rotavirus.
Figure 4 : Prévalence de l’infection à rotavirus dans la population d’étude.
Des 34 échantillons de selles testés, 8 ont été positifs au rotavirus soit un taux de positivité de 23,5%.
23,5
76,5
100
POSITIF NÉGATIF TOTAL
Echantillons
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2727
1.4. Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus 1.4.1. Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus et le sexe.
Tableau VI : Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus et le sexe.
Sexe
Positifs Négatifs N (%) N (%) N (%)
Total N (%) Masculin 02 (8,3) 22 (91,7) 24 (100) Féminin 06 (60) 04 (40) 10 (100) Total 08 (23,5) 26 (76,5) 34 (100)
N : Nombre
Les enfants de sexe féminin, ont été plus touchés (60%) que ceux du sexe masculin (8,3%).
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2828
Figure 5 : Répartition des tranches d’âges des enfants en fonction de la diarrhée à rotavirus.
Les enfants appartenant aux tranches d’âges de 7 à 12 mois et de 19 à 24 mois ont été les plus touchés.
0 0,5 1 1,5 2 2,5
0 à 6 7 à 12 13 à 18 19 à 24 ≥25
Nombre de cas
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 2929
1.4.2. Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus et selon le statut d’hospitalisation et l’état de déshydratation.
Tableau VII : Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus et selon l’hospitalisation.
Hospitalisation
Positifs Négatifs N (%) N (%)
Effectif N (%) Oui 02 (12,5) 14 (87,5) 16 (100) Non 06 (33,3) 2 (66,7) 18 (100) Total 08 (23,5) 26 (76,5) 34 (100)
N : Nombre
La diarrhée à rotavirus a été détectée chez 33,3% (06/08) des enfants non hospitalisés. Par contre, 87,5% (14/16) des enfants hospitalisés n’avaient pas de rotavirus dans leurs selles.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3030
1.4. 3. Répartition des enfants en fonction de la diarrhée à rotavirus associée au vomissement et à la fièvre.
Tableau VIII : Répartition des enfants en fonction de la diarrhée à rotavirus associée au vomissement.
Vomissement
Positifs Négatifs N (%) N (%) Oui 08 (100) 14 (53,8) Non 00 (0) 12 (46,2) Total 08 (100) 26 (100)
N : Nombre
Le vomissement a été observé chez tous les enfants souffrant de la diarrhée à rotavirus.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3131
Tableau IX : Répartition des enfants en fonction de la diarrhée à rotavirus associée à la fièvre.
Fièvre
Positifs Négatifs N (%) N (%)
Total N %
Présent 06 (42,9) 08 (57,1) 14 (100) Absent 02 (10) 18 (90) 20 (100)
Total 08 (23,5) 26 (76,5) 34 (100)
N : Nombre
Au nombre des enfants ayant présenté une fièvre, 57,1% (08/14) n’avaient pas de diarrhée à rotavirus. De même, 10% (02/20) des enfants non fièvreux avaient la diarrhée à rotavirus.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3232 garçons (8,3%). Lesmêmes observations ont été faites au Kenya en 2017 puis au Benin en 2018 [3 ; 2], révélant une prédominance du sexe féminin.
Le taux de positivité de cette infection a été de 23,5%. Ce taux est proche de celui enregistré en Russie [22], et supérieur à 21,1% obtenu en Tunisie en 2009 [16]. En Mai 2018, Agbla et al., ont eu 39,2% qui est supérieur au taux de positivité obtenu dans cette étude [2]. La courte durée de collecte des échantillons pourrait expliquer ce taux obtenu. Aussi, selon des données sur la distribution saisonnière du rotavirus, l’infection est plus fréquente dans les pays développés en période hivernale. Le niveau d’instruction et le niveau social de la majorité des parents d’enfants recrutés lors de cette étude ont permis de garantir un minimum d’hygiène, et donc de prévenir l’incidence accrue des maladies dites « de mains sales » comme l’infection à rotavirus.
Les enfants infectés par le rotavirus étaient âgés de 7 à 12 mois et 19 à 24 mois ; l’infection a donc majoritairement touché les enfants de moins de deux ans. Les observations similaires ont été rapportées au Nigéria en 2011[12]. Par contre, en 2014 au Zimbabwe [17] les enfants de la tranches d’âges de 12 à 24 mois ont été les plus touchés, suivis de ceux de 0 à 12 mois. Cette répartition de la diarrhée à rotavirus en fonction de l’âge, pourrait s’expliquer par le fait que les enfants, notamment les nouveaux nés sont protégés par le lait maternel qui contient des facteurs bioactifs qui renforcent leur système immunitaire immature et leur offrent tous les nutriments dont ils ont besoin au cours des six premiers
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3333
mois de leur vie. Ces nouveaux nés sont aussi protégés par le fort taux d’anticorps transplacentaires acquis de leurs mères.
En effet, les anticorps maternels protègent l’enfant efficacement les premiers mois. Cette protection régresse avec l’âge et est perdue lorsque l’enfant avoisine 6 mois. Ceci pourrait expliquer la recrudescence des cas à partir de 6 mois et l’absence de cas aux premières semaines de vie de l’enfant.
La diarrhée à rotavirus a été détectée plus, chez des enfants non hospitalisés (33,3%) dans la population d’étude. Ces enfants pourraient représentés une source de contamination pour les autres enfants compte tenu surtout du niveau d’hygiène dans notre pays. Chez tous les enfants, le vomissement a été observé.
Aussi, dans la population d’étude, la diarrhée à rotavirus a été détectée chez des enfants non fièvreux. Cette situation montre que, l’infection à rotavirus chez les enfants ne s’accompagne pas toujours de la fièvre comme l’a indiqué la littérature.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3434
CONCLUSION
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3535
En somme, la présente étude confirme la présence de l’infection à rotavirus au Benin et en particulier dans les villes d’Abomey – Calavi et de Cotonou. Le taux de positivité des diarrhées infantiles à rotavirus dans ces villes a été évalué à 23,5%. Les enfants de la tranche d’âge de 7 à 12 mois et 19 à 24 mois ont été les plus touchés. Aucun cas de diarrhée à rotavirus n’a été observé avant le premier trimestre de vie chez ces enfants.
La présente étude devra être complétée par des études moléculaires afin de rechercher les profils de la protéine VP6 en électrophorèse et les génotypes de rotavirus circulants au Bénin.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3636
Recommandations
A l’issue de cette étude, nous recommandons à l’endroit du Ministère de la Santé :
1- L’installation et la formalisation des sites de surveillance des rotavirus sur toute l’étendue du territoire en vue d’avoir des feedbacks permanents et donc une maitrise des souches circulant dans chaque localité ;
2- L’institution du vaccin contre les rotavirus dans le PEV.
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 3737
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Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 4141 Annexe : Fiche d’enquête (Etude sur les rotavirus)
Dossier médical N° : --- Numéro _________ Nom hôpital ……….
Date d’hospitalisation : ---/---/---/ Date d’admission : ---/---/---/ (Jour/Mois/ Année)
Information sur le patient : Nom du Père/Mère : --- Prénoms de l’enfant : ---
Commune de résidence : --- Ville : --- Quartier : --- Tél : --- Age (Mois) : --- Date de naissance : ---/---/---/ Poids (kg) : ---Sexe : M F
Traitement reçu : SRO seul () ; IVF () ; SRO +IVF () ; Autre (préciser) ---
Profession de la mère………Niveau d’étude : Primaire…Secondaire…. Universitaire…. Aucun
…….
Profession du père………Niveau d’étude : Primaire…Secondaire……. Universitaire …… Aucun…….
Revenus mensuels…………
Lieu de résidence : En Location………Chez soi………
Information clinique :
L’enfant a – t - il vomi : --- (Oui/Non) No d’épisodes/24h : --- Durée (Jours) : --- L’enfant fait-il la diarrhée : --- (Oui/Non) No d’épisodes/24h : --- Durée (Jours) : --- Date de début de la diarrhée : ---/---/---/ (Jour/Mois/ Année) Température : ---°C
Léthargie/inconscient : --- (Oui/Non) Yeux creux : --- (Oui/Non) Difficultés à boire : --- (Oui/Non) Pli cutané : --- (Oui/Non) Etat de déshydratation : Sévère () Evident () Aucun ()
Statut vaccinal :
Vaccin contre Rota reçu : ---- (Oui/Non) Type de vaccin : Rotateq () Rotarix () Autre : --- Source de l’information : Carte vaccination () Registre médical () Rapport verbal () Inconnue () Issue : Améliorée () ; Transférée () ; Décédée () ; Contre avis médical () ; Inconnue ()
Date de sortie ou de décès : ---/---/---/ (Jour/Mois/ Année)
Information de Laboratoire : Date de prélèvement des selles : ---/---/---/ (Jour/Mois/ Année) Heure de prélèvement : ---
Etat de l’échantillon : Adéquat () Non adéquat ()
Moyen de conservation des selles : () Glacière () Réfrigérateur () Congélateur () Aucun Date d’envoi au Laboratoire : ---/---/---/ (Jour/Mois/ Année)
Date de réception au Laboratoire : ---/---/---/ (Jour/Mois/ Année)
Rotavirus dépisté dans les selles : --- (Oui/Non) Si <<Oui>> Méthode utilisée : ---
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 4242
TABLE DES MATIERES
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 4343
LISTES DES ENSEIGNANTS PERMANENTS ET VACATAIRES ... ii
DEDICACE ... iv
CHAPITRE II :MATERIEL ET METHODES ... 11
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 4444
1. CADRE ... 12
1-1. Cadre institutionnel... 12
1.2. Cadre technique ... 12
1.2.1- Attributions du Laboratoire National de Santé ... 12
1.2.2. Organisation du Laboratoire National de Santé Publique ... 13
2. MATERIEL ... 16
3.1.2. Critère de non inclusion ... 17
3.2. Prélèvement ... 17
3.3. Recherche de l’antigène VP6 ... 17
CHAPITRE III :RESULTATS ET COMMENTAIRES ... 20
1.RESULTATS ... 21
1.1. Caractéristiques épidémiologiques de la population d’étude. ... 21
1.2. Répartition de la population d’étude en fonction de l’hospitalisation de l’état de déshydratation, de la fièvre, du vomissement. ... 22
1.3. Prévalence de l’infection à rotavirus. ... 26
1.4. Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus ... 27
1.4.1. Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus et le ... 27
sexe. ... 27
1.4.2. Répartition de la population en fonction de la diarrhée à rotavirus et ... 29
Présenté et soutenu par GANGBO Hermione Déo Gratias A. 4545
1.4. 3. Répartition des enfants en fonction de la diarrhée à rotavirus associée au ... 30
2. COMMENTAIRE ... 32
CONCLUSION ... 34
Recommandations ... 36
Références bibliographiques ... 37
Annexe : Fiche d’enquête ... 41
TABLE DES MATIERES ... 42