Mesures et prélèvements en cours d'expérimentation

Les quantités distribuées et refusées ont été pesées chaque jour. La teneur en MS du foin a été réalisée au début de l’expérimentation puis tous les jours de mesure et pour chaque période expérimentale.

 Les mesures de digestibilité et de bilan azoté : elles ont été réalisées en semaine 3 de chaque période expérimentale sur 5 jours de collecte.

 Récolte des Fèces : 10% de la récolte de fèces ont été transférés dans des sachets de 5 kg maintenus hermétiquement au congélateur (1 sachet/animal/période), puis lyophilisés pour analyse de l’azote. Dix pourcent de la récolte de fèces ont été séchés à poids constant dans une étuve ventilée, puis conservés à température ambiante (1 bidon/animal/période) pour analyses de la MO et des parois.

 Récolte d’urines : un échantillon de 2,5% de la récolte d’urine a été dilué au ¼ avec de l’eau (1 vol urine + 3 vol eau), transféré dans un bidon de 30 L et gardé à +4°C pour l’analyse de l’azote total.

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Les dosages de l’azote et des fractions pariétales ont été réalisés selon les méthodes de Dumas et Van Soest, respectivement (Annexe 5, 6).

I.6/ Méthane

Pour la mesure des émissions de CH4, la méthode de l'hexafluorure de soufre (SF6) a été utilisée. Cette technique mise au point par Johnson et Huyler (1994) permet de quantifier

in vivo le CH4 produit par les ruminants. Elle repose sur le principe de dilution d'un gaz traceur inerte introduit dans le rumen, capable de se mélanger aux autres gaz issus des fermentations (CH4, CO2…). Ce gaz traceur, SF6, est introduit dans le rumen à l’aide d’une capsule perméable, dont la vitesse de diffusion est préalablement déterminée in vitro.

La collecte des gaz est réalisée grâce à un système d’aspiration fixé sur un licol adapté à la tête de l’animal, et relié à une boîte dans laquelle l’échantillon gazeux vient s’accumuler (Figure 15).

Figure 15. Bovin équipé du dispositif de collecte des gaz

Les concentrations en SF6 et CH4 de cet échantillon ont été ensuite déterminées par analyses chromatographiques. A partir de ces concentrations, et connaissant la vitesse de diffusion du SF6 de la capsule, on en déduit la vitesse de production du CH4.

Boîte de collecte des gaz

Méthane

Licol + tube capillaire

Gélule perméable diffusant le gaz traceur SF6 (g/j) gaz traceur CH4 (g/j)= SF6 (g/j) x CH 4 SF 6 (µg/m3)

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Le principe de fabrication consiste à introduire une quantité précise de gaz SF6 dans une capsule en laiton et d'en mesurer la vitesse de diffusion (flux de SF6 en ng/j) à travers une membrane en téflon, dont l’épaisseur conditionne la vitesse de sortie du gaz (Figure 16).

Figure 16. Les différents composants du système de collecte des gaz

Filtre 60µm Tube capillaire inox

(0.13mm de diamètre interne et 1.59mm de diamètre externe)

Boîte de collecte en PVC maintenue

autour du cou de

l’animal ^{Tube téflon 3.18mm de}

diamètre interne Raccord

rapide

Partie 1:

Boîte de collecte _{Système d’aspiration} ^{Partie 2:}

15 mm 35 mm

Partie1 Partie 2

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 Remplissage: l’introduction du gaz SF6 a été réalisée par immersion du corps de la

capsule dans un bain d'azote liquide. Lorsque la capsule a atteint une température cryogénique maximale (-196°C), elle a été retirée du bain d'azote liquide puis remplie à l'aide de seringues contenant du gaz SF6 pur. Au contact du froid interne de la capsule, le gaz se solidifie ce qui permet de visualiser son niveau de remplissage. Après fermeture, la capsule a été disposée dans un erlenmeyer balayé par un flux d'azote gazeux et maintenue à la température d’utilisation future (ex : 39°c pour le milieu ruminal).

 Calibration: l'estimation de la vitesse de diffusion du gaz SF6 est primordiale pour le calcul de la production de CH4. La détermination de la vitesse de diffusion du gaz à travers la membrane s’effectue par gravimétrie (précision au 1/100ème de mg) (Annexe 7). Six à huit semaines de pesées sont généralement nécessaires pour obtenir une valeur de diffusion du gaz correcte et stable (variation < 8%). D’autre part, on estime la durée de vie de la capsule à partir de sa vitesse de diffusion et de la quantité de gaz présente.

 Adaptation au licol et distribution du gaz traceur

Le gaz traceur, (SF6), a été donné à l’animal deux semaines avant le début des mesures de façon à ce que la diffusion du gaz dans le rumen soit stabilisée au moment des premières mesures de production de gaz. Les bolus SF6 (capsule) sont déjà présents dans le rumen. Cette capsule est perméable au SF6 qui se diffuse en continu et à vitesse constante dans le rumen. La vitesse de diffusion du SF6 a été préalablement déterminée in vitro. Les capsules fabriquées de telle sorte que leur durée de vie couvre la durée totale de l’expérience (> 3 mois). Au début de l’expérience, on a équipé l’animal d’un licol pour qu’il s’habitue à ce dernier. A la fin de l’essai, la totalité des capsules ont été récupérées. Un licol équipé d’un capillaire a été placé sur l’animal au début de l’essai. Ce capillaire, positionné près des naseaux, a été relié lors des mesures à une boîte de collecte des gaz, placée en hauteur sur la partie métallique de la mangeoire. Dans cette boîte a été recueilli un échantillon représentatif des gaz du rumen (éructation) et des poumons (expiration).

 Prélèvements de gaz

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avant le repas du matin. Chaque jour une boîte a été installée pour prélèvement de l’air ambiant. Les boîtes ont été acheminées immédiatement au laboratoire pour analyser les différents gaz nécessaires à l’estimation de la production de CH4 :

QCH4 (g/j) = vitesse diffusion SF6 x ([CH4]/[SF6])

I.7/ Fermentations ruminales et écosystème microbien

Un échantillon d’environ 150 mL de contenu ruminal a immédiatement été prélevé à travers la canule, à l’aide d’une canne avant le repas, puis 3 h après le repas.

I.7.1/ Paramètres fermentaires et protozoaires

Environ 75 mL ont été filtrés à travers des mailles de 250 µm pour récupérer la phase liquide dans un flacon de 100 mL. Le pH a été mesuré le plus rapidement possible. La phase liquide a servi à l’échantillonnage des AGV, du NH3 et des protozoaires selon les méthodes décrites dans la première partie pour les essais in vitro.

I.7.2/ Paramètres microbiens et biologie moléculaire

Un premier échantillon de contenu ruminal d’environ 30 g a été prélevé, auquel 15 mL de PBS (7,65 g de NaCl, 0,724 g de Na2PO4 et 0,210 g de NaPO4, qsp 1L d’eau distillée) autoclavé ont été rajoutés. L’ensemble a été homogénéisé au Polytron 3 x 1 min, séparé par 1 min de repos dans la glace. Sur cet échantillon on a prélevé :

 Un sous-échantillon pour l’extraction d’ADN : 2 échantillons de 1,5 mL de contenu ont été prélevés. Ils ont immédiatement été conservés dans la glace, puis transférés à -80°C.

 Un second échantillon de 5 g de contenu a été déposé dans une microplaque 6 puits, conservé dans la glace, puis transféré dès que possible à -20°C avant lyophilisation. Les échantillons lyophilisés ont servi de réserve. Le reste du contenu a servi à la réalisation d’une MS à 103°C pendant 24 h. Les prélèvements ont été traités aussi rapidement que possible.

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