Abreviaturas
AA – Ácido L – ascórbico ADP – Difosfato de adenosina ATP – Tri-fosfato de adenosina
ATR – Reflectância total atenuada (Attenuated Total Reflectance) CoA – Coenzima A
DHA – L-dehidroascórbico F-6-P – Frutose-6-fosfato
FT-IR – Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared)
FTIR-MID – Espectroscopia de infravermelho médio com transformada de Fourier (Fourier Transform Mid Infra Red)
FT-NIR – Espectroscopia de infravermelho próximo com transformada de Fourier (Fourier Transform Near Infra Red)
Fru – Frutose G-6-P – Glucos-6-fosfato G6P-DH – Glucose-6-fosfato desidrogenase Glu – Glucose HK - Hexocinase IR – Infravermelho (Infrared) LV – Variável latente
MIR – Infravermelho médio (Mid Infrared) NAD – Dinucleotídeo de nicotinamida – adenina
NADP – Dinucleotídeo de nicotinamida – adenina- fosfato
NIPALS – Algoritmo parcial em mínimos quadrados iterativo não linear (Non-linear Iterative Partial Algorithm Least Squares)
NIR – Infravermelho próximo (Near Infrared) OPP – Pentose fostato oxidativa
PCA – Análise em componentes principais (Principal Component Analysis) PCR – Regressão em componentes principais (Principal component Regression) PFK – Fosfofrutocinase
PGI - Fosfoglucoisomerase PK - Piruvatocinase
PLS – Regressão parcial em mínimos quadrados (Partial Least Squares regression) PPK – Fosfofrutocinase pirofosfato
PPO – Polifenol oxidase R – Coeficiente de Correlação
RMSEP – Erro médio de previsão (root mean square error of prediction)
RMSEC – Erro médio de calibração (root mean square error of cross-validation) R2 – Coeficiente de determinação
Sac – Sacarose
SG – Savistsky-Golay
SVD – Decomposição singular de valores (Singular Value Decomposition) TCA – Cíclo do ácido tricarboxílico
UV – Ultravioleta
Capítulo I
I.1 – Introdução
A Espectroscopia de Infravermelho (médio e próximo) representa uma ferramenta importante para o controlo da qualidade e processo de monitorização na indústria alimentar, sendo uma técnica de relativo baixo custo, quando tomada em consideração a diminuição do consumo de reagentes, mão-de-obra e tempo de análise. A espectroscopia de infravermelho oferece uma técnica alternativa, rápida e não destrutiva a técnicas de análise química para a caracterização qualitativa e medidas quantitativas em produtos alimentares [1,2,3].
O Infravermelho próximo (FT-NIR) e o médio (FT-IR) aliado à utilização da análise multivariada, foram usados para determinar a autenticidade de alimentose mostraram ser úteis para detectar problemas de adulterações em puré de framboesa, fiambre, azeite, óleos vegetais, presença de gordura de porco em mistura de gorduras animais, outras gorduras vegetais em manteiga de cacau, café, mel, sumo de laranja, leite, carne, e outros produtos [2,3,4].
A aplicação de FT-NIR aos óleos e gorduras tornou-se muito comum para os estudos da qualidade e de composição. Nos azeites, o NIR é usado para a previsão/identificação de adulterações, diferenciação/classificação de óleos vegetais e monitorização on-line de carotenóides e pigmentos de clorofila [5].
No caso de espectroscopia NIR, para a detecção típica é usada a região entre 10000 e 4000 cm-1. No caso de espectroscopia FT-IR, as regiões de interesse são 3100-2800 cm-1 e 1800-900 cm-1 para os óleos e gorduras. São usadas as regiões 1800-1200 e 3200-2800 cm-1 para os hidratos de carbono, os ácidos carboxílicos e os aminoácidos. A região 1200- 700 cm-1 (região de impressão digital) é usada para os hidratos de carbono [6].
I.2 – Objectivos
O projecto pretende desenvolver aplicações de técnicas de análise rápidas como o Infravermelho médio, Ultravioleta/Visível na:
• Quantificação de parâmetros físico-químicos de alimentos, com particular relevância em sumos de fruta.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a quantificação de açúcares em sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a quantificação de ácido ascórbico em sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a quantificação de ácido cítrico em sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a diferenciação/classificação de sumos.
• Desenvolvimento de uma técnica de análise rápida para a previsão/identificação de adulterações em sumos.
I.3 – Espectroscopia de Infravermelho
I.3.1 – Espectroscopia de Infravermelho com Transformadas de Fourier (FTIR) O espectro electromagnético está dividido em várias regiões: raios gama, raios X, ultra- violeta, visível, infra-vermelho, micro-ondas e radio-frequências.
Cada uma destas regiões possui diferentes energias, que está relacionada com um tipo de transição atómica ou molecular. Desta forma, a radiação IR, não provoca as mesmas transições electrónicas que as suas congéneres ultra-violeta, visível ou raios-X. A radiação do Infravermelho não tem energia suficiente para provocar excitação dos electrões, conseguindo apenas alterar os estados vibracionais e rotacionais das moléculas, podendo ser usado como técnica espectroscópica não destrutiva [7].
A radiação no infra-vermelho é dividida em três tipos: IR longínquo, IR médio e IR próximo, sendo a mais popular e usada em química alimentar a do infravermelho próximo (NIR) [8].
A posição de absorção de uma banda no espectro pode ser expressa em microns (µm) ou em comprimentos de onda (cm-1) sendo esta mais comum (Tabela 1). O intervalo usual de um espectro de infravermelho é entre 4000 cm-1 para as altas frequências e 625 cm-1 para as baixas frequências [9].
A exploração da espectroscopia de FTIR tem uma série de vantagens: rapidez, possibilidade de realizar análises não destrutivas e sem pré-tratamento ou reduzido das amostras.
Tabela 1 – Regiões do infra-vermelho e respectivos intervalos de comprimento de onda e número onda
Região Gama de comprimentos de onda (λ), µm Número de onda (µ), cm-1
Próximo 0,78 – 2,5 12800 - 4000
Médio 2,5 - 50 4000 - 400
Longínquo 50 – 1000 400 - 10
De uma forma simples, pode-se dizer que, quando a frequência da radiação infra- vermelho emitida é igual à frequência vibracional da molécula, dá-se a absorção de energia por parte desta, resultando numa alteração da amplitude de vibração molecular. De forma semelhante ocorre para a rotação.
Para as moléculas absorverem energia na gama do infra-vermelho, tem de ocorrer uma alteração do momento de dipolo como consequência dos seus movimentos vibracional e rotacional.
A variação do momento dipolar com a alteração da distância inter – atómica durante a vibração, corresponde a um campo eléctrico oscilante que pode interactuar com o campo eléctrico oscilante associado à radiação electromagnética.
Quanto maior a simetria da molécula, menor o número de bandas observadas, pois algumas ligações absorvem à mesma frequência.
A intensidade das bandas depende da natureza e da polaridade das ligações. Por exemplo, a ligação C=O, fortemente polar e composta de átomos diferentes, absorve fortemente, enquanto que a ligação C=C tem relativamente fraca absorção.
As moléculas com um mesmo grupo funcional apresentam, nos seus espectros, bandas sensivelmente à mesma frequência, independentemente da sua cadeia atómica principal, sendo esta absorção denominada frequência de grupo. Estas frequências encontram-se a números de onda superiores a 1300 cm-1.
A região 1300-400 cm-1 contém bandas vibracionais que são mais dificilmente atribuíveis a grupos funcionais específicos, uma vez que as massas e as forças de ligação de cada uma das espécies absorventes são muito similares. No entanto, esta região contém
bandas com especial significado para a molécula como um todo, sendo denominada de região das impressões digitais [7].
As bandas na região das frequências de grupo são facilmente identificáveis pelas tabelas; no entanto, as bandas na zona das impressões digitais devem-se por vezes a mais de uma ligação ou grupo funcional (Figura 1).
1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 Alcanos OCOCH3 e COCH3 C(CH3)3 C(CH3)2 CH=CH trans Outros olefinicos C-H O-H C=O 5-aromático adjacente C-H 4-aromático adjacente C-H 3-aromático adjacente C-H 2-aromático adjacente C-H 1-aromático isolado C-H C NO3 O NO3 N NO3 N =O N O C=S CSNH SO SO2 SO2N SO2O SO2Cl P O alquil P O aril P=O P Sr-CH3 C-F C Cl
I.3.2 – O espectrómetro de FT-IR
A maioria dos interferómetros usados em espectroscopia de infravermelho é baseada no primeiro interferómetro originalmente desenhado por Michelson em 1891 [10].
A fonte de radiação usada neste tipo de espectrómetros – Globar (SiC) – emite uma gama de comprimentos de onda que abrange toda a gama do infra-vermelho médio.
Na Figura 2 pode-se observar o esquema de um interferómetro de Michelson.
Figura 2 – Esquema de um interferómetro de Michelson
A radiação enviada pela fonte passa por um orifício e é orientada por espelhos antes de chegar a um divisor de feixe. Aí, uma parte da radiação continua na mesma direcção, interagindo com um espelho em movimento, enquanto que a outra parte da radiação é reflectida para um espelho fixo. Posteriormente a radiação, tendo sido reflectida pelos espelhos, chega novamente ao divisor de feixe, sendo mais uma vez dividida, levando apenas uma parte a interferir com a amostra, reduzindo a amplitude de algumas frequências, e chegando então ao detector.
O espelho móvel pode mover-se de uma forma muito precisa e a uma velocidade determinada, de uma extremidade à outra do seu eixo. O movimento permite adquirir uma curva de intensidade da energia que chega ao detector em função do espaço percorrido pelo espelho – o interferograma. Tendo o interferograma médio, aplica-se a transformada de
Fourier, obtendo-se um espectro de transmitância em função da frequência. Este pode ainda ser facilmente convertido num espectro de absorvância em função da frequência (ou do número de onda).
O espectrómetro possui um detector piroeléctrico DTGS (sulfato de triglicina deuterado), que é termo-sensível, reagindo à alteração de temperatura provocada por uma radiação incidente. O espelho móvel permite codificar a quantidade de energia incidente através do uso da transformada de Fourier, permitindo a passagem do domínio do espaço- tempo para o domínio da frequência.
O espectro infravermelho representa a curva da intensidade transmitida em função do comprimento de onda, da frequência ou da energia da radiação incidente.
I.3.3 – Modos de aquisição dos espectros
Em espectroscopia FT-IR, as duas formas mais utilizadas de aquisição de espectros são a transmissão e a reflexão total atenuada (ATR).
Na técnica de transmissão, as amostras sólidas podem ser misturadas com KBr e prensadas, formando uma “pastilha” que pode ser atravessada pela radiação
Em amostras líquidas, estas são colocadas numa célula-contentor específica ou, em amostras mais viscosas, entre duas janelas de KBr.
Esta técnica tem o inconveniente da espessura da amostra, pois o feixe tem de atravessar completamente a amostra o que, de acordo com a lei de Beer-Lambert, diferentes espessuras implicam diferentes absorções de energia. Em transmitância, a proporção de energia luminosa absorvida pelas moléculas é calculada a partir do conhecimento da radiação incidente e da radiação transmitida ao detector, pois a radiação reflectida é desprezável.
A técnica de espectroscopia ATR utiliza o fenómeno de reflexão interna total. O feixe da radiação penetrando um cristal submete-se a uma reflexão interna total quando o ângulo de incidência na interface ente a amostra e o cristal for superior ao ângulo crítico, onde este é uma função dos índices de refracção de duas superfícies. O feixe penetra uma porção de comprimento de onda além da superfície reflectindo quando o material que absorve selectivamente a radiação está em estreito contacto com a superfície reflectindo. Há uma perda de energia do feixe ao comprimento de onda onde o material absorve. É medida a radiação atenuada resultante, e usada pelo espectrofotómetro como uma função de comprimento de onda, dando assim as características espectrais de absorção da amostra [11].
Este método é utilizado na análise de sólidos e de líquidos pouco ou muito viscosos. Os modelos de cristais de ATR são vários, com especificidades diferentes; contudo, é o tamanho do cristal que vai determinar o número de interacções que o feixe tem com a amostra.
Figura 4 – Esquema de um dispositivo de ATR [12]
I.4 – Espectrofotometria de Ultravioleta/Visível
A espectrofotometria é um método de análise óptico muito usado em análises biológicas e físico-químicas sobretudo na área alimentar. O espectrofotómetro permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante.
A espectrofotometria no ultravioleta visível (UV/Vis) envolve fotões, e utiliza a luz na faixa do visível (800 a 400 nm), do ultravioleta próximo (400 a 200 nm) e ultravioleta longínquo (200 a 80 nm). Nessas faixas de energia, as moléculas sofrem transições electrónicas moleculares.
Os espectros de ultravioleta e visível são associados a transições entre diferentes níveis de energia electrónica. Geralmente essas transições ocorrem entre uma orbital ligante σ e
Detector Fonte
uma orbital anti-ligante σ*. O comprimento de onda da absorção corresponde a medição da separação dos níveis de energia entre as orbitais. A maior energia de separação é encontrada quando os electrões das orbitais σ estão excitados resultando numa absorção na região 120-200 nm. Esse gama, conhecida como o ultravioleta de vácuo, é difícil de medir e pouca informativa. No entanto, acima de 200 nm, a excitação dos electrões das orbitais p e d e as orbitais π, particularmente os sistemas π conjugados, oferece espectros de fácil medição e informativos.
É usada a Lei de Beer-Lambert para determinar quantitativamente a concentração de substâncias em solução que absorvem a radiação:
A = - log10 (I/Io) = ε . c . L Onde:
A é a absorvância medida
Io é a intensidade da luz incidente a um dado comprimento de onda I é a intensidade transmitida pela amostra
L é o percurso óptico da amostra (distância que a luz percorreu pela amostra)
ε é a absortividade molar (ou coeficiente de absorção molar, específica para cada substância)
c é a concentração da substância [9,13, 14, 15, 16].
A espectrofotometria de Ultravioleta/Visível fornece um método rápido de análise para a determinação de compostos fenólicos em vários alimentos usando um procedimento colorimétrico [17,18]. Permite também estimar de forma rápida os açúcares principais em sumos [19,20]. O método mais usado é baseado na determinação da concentração do NADPH. A concentração da D-Glucose é determinada antes e depois da hidrolise da sacarose pela β-frutosidase. O teor da D-Frutose é determinado na sequência da determinação da D-glucose, depois da isomerização pela fosfoglucose isomerase. A pH igual a 7,6 e na presença da ATP, a hexocinase (HK), catalisa a fosforilação da D-Glucose em glucose-6-fosfato (G-6-P) com a formação de ADP (difosfato de adenosina) (reacção 1).
(HK)
Na presença da Glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH), a G-6-P é oxidada em gluconato-6-fosfato pelo dinucleotídeo de nicotinamida-adenina-fosfato (NADP+) com a formação do dinucleotídeo de nicotinamida-adenina-fosfato na forma reduzida (NADPH) (reacção 2)
(G6P-DH)
G-6-P + NADP+ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ (2)
Nesta reacção, o teor de NADPH formado é estequiométrico com o teor de D-Glucose. O NADPH é quantificado pelo aumento da absorvância a 340 nm.
A hexocinase catalise também a fosforilação da D-Frutose em frutose-6-fosfato (F-6-P) pelo ATP com formação de ADP (reacção 3).
(HK)
D-Frutose + ATP F-6-P + ADP (3)
A F-6-P é convertido em G-6-P pela fosfoglucoisomerase (PGI) (reacção 4)
(PGI)
F-6-P G-6-P (4)
A G-6-P reage com NADP+ formando o gluconate-6-fosfato e NADPH, levando a um aumento suplementar da absorvância que é estequiométrico ao teor de D-Frutose.
A pH 4,6, a sacarose é hidrolisada pela β-frutosidase em D-glucose e D-frutose (reacção5).
(β-frutosidase)
Sacarose + H2O D-glucose + D-frutose (5)
Depois da hidrólise da sacarose a D-glucose da amostra (D-glucose total) é determinada como descrita acima (reacções de 2 a 4)
A concentração da sacarose é calculada entre a diferença entre as concentrações da D- glucose antes e depois da hidrolise pela β-frutosidase [21,22,23]. Esta técnica de análise pode ser usada como uma ferramenta complementar na detecção de adulterações em alimentos.
I.5 – Análise Multivariada
A análise estatística multivariada diz respeito à aplicação de técnicas de cálculo matricial para a recuperação de fontes de informação em várias dimensões. Uma das dificuldades dos métodos descritivos para dados dimensionais elevados é o sistema de percepção humano. As nuvens de ponto em duas dimensões são fáceis de compreender e interpretar. Com técnicas computacionais interactivas modernas, temos a possibilidade de ver em tempo real rotações em 3D e perceber assim dados tridimensionais.
As dificuldades da apresentação dos dados ocorrem para as dimensões superiores ou igual a cinco, a menos que a estrutura de elevada dimensão possa ser traçada como componentes de baixa dimensão. As características como subgrupos ou aglomerados, entretanto, podem ser detectadas usando uma análise puramente gráfica [24].
Por outro lado, devido a uma complexidade elevada dos sistemas químicos e biológicos, deve-se utilizar técnicas instrumentais tais como a espectroscopia, espectrofotometria, cromatografia, para os poder estudar. Contudo, os sinais obtidos apresentam uma tal complexidade que é difícil de interpretar. No entanto a quimiometria vai permitir a extracção da variabilidade dos sinais e facilitar assim a compreensão dos modelos resultantes. A quimiometria utiliza métodos matemáticos, estatísticos, técnicas de lógica formal e computação para:
- Planear e/ou seleccionar métodos ou procedimentos óptimos
- Extrair o máximo de informação possível através da análise de dados químicos.
Pode-se assim obter um sistema de três tipos de informação: 1) Informação quantitativa
2) Informação qualitativa
3) Informação fundamental sobre as propriedades que o caracterizam
A análise multivariada apresenta diferentes ferramentas de análise. No entanto, é necessário seleccionar a ferramenta adequada para um determinado tipo de análise. Algumas ferramentas disponíveis em análise multivariada são:
- Noções de cálculo vectorial/matricial - Formas e estruturas de sinais típicos - Análise em componentes principais (PCA)
- Regressão multivariada:
Regressão linear multivariada (MLR) Regressão de Ridge (RR)
Regressão em componentes principais (PCR) Regressão multivariada parcial (PLS1 e PLS2) - Análise factorial de correspondência
- Análise discriminante (FDA) - Análise canónica de correlação
- Métodos de selecção de variáveis [25]
A interpretação dos dados em análise multivariada depende decisivamente do pré- processamento dos dados. Raramente os dados são usados na sua forma original [26].
Os dados obtidos através de FT-IR são os espectros da amostra subtraídos de um espectro do fundo, de forma a retirar ao espectro da amostra a contribuição da célula e do meio ambiente. Cada espectro destes é representado por um vector, que consiste num conjunto de valores de transmitância (ou absorvância) observados a determinados comprimentos de onda para uma determinada amostra.
Os espectros são geralmente transformados antes da análise multivariada. As razões para estas transformações são várias; por exemplo: minimizar efeitos de linha de base, dar igual peso às variáveis, mover o sistema de coordenadas de forma a ter o centro em zero, maximizar diferenças entre os espectros, aumentar a resolução, etc.
Os dados são normalmente apresentados de forma que cada espectro (objecto) seja uma linha de uma matriz de valores iniciais, sendo as colunas os diferentes comprimentos de onda (variável).
I.5.1 – Centrar
Centrar consiste em subtrair a cada um dos valores do espectro (ou de uma variável) a respectiva média. Assim sendo, os dados centrados representam a diferença entre cada valor e a média do espectro (ou da variável), para que o baricentro fique na origem. Esta operação pode ser realizada antes ou depois de uma outra transformação. Centrar pode ser importante em alguns conjuntos de dados com problemas na linha de base ou quando se usa uma pequena região do espectro dos dados [26].
I.5.2 – Padronizar
Esta operação consiste em dividir por cada um dos valores do vector o desvio padrão do mesmo. Matematicamente, se se pretende padronizar um vector, temos então, para cada valor i do vector x:
Pode ser aplicado a uma amostra ou a uma variável. Se aplicado às variáveis, atribui- lhes um peso semelhante, ou seja, todas as variáveis são reduzidas à mesma escala, o que é importante no caso de se querer anular diferenças grandes nas suas magnitudes. Quando aplicado às amostras, pode por exemplo, homogeneizar réplicas e ao mesmo tempo maximizar diferenças entre amostras. Brereton refere que deve ser usado após centrar os dados [26].
I.5.3 – Análise em componentes principais
A técnica de análise em componentes principais (PCA), inicialmente descrita por Karl Pearson em 1901, recebeu contribuições matemáticas de Hotelling na década de 1930, mas teve de esperar pelo aparecimento dos computadores para ser largamente aplicada no domínio das ciências sociais, naturais e exactas, estabelecendo-se como uma peça base da análise multivariada [27].
Uma das razões para aplicar a Análise em Componentes Principais reside na sua capacidade de analisar uma quantidade enorme de dados, como aqueles produzidos pelos modernos equipamentos digitais.
A abordagem de estudar cada um dos sinais (individualmente) e extrair as suas propriedades torna virtualmente impossível utilizar/analisar inteligentemente os dados. Por exemplo a análise de 300 objectos de ar onde 150 substâncias (variáveis) são quantificadas origina uma matriz de 150x300 = 45000 elementos a analisar.
A PCA procura extrair as principais fontes de variabilidade de um conjunto de dados: relação entre amostras; descriptores (variáveis) e amostra/variáveis, através da factorização da matriz.
Como técnica exploratória, permite a visualização dos dados após a projecção das amostras no espaço multi-dimensional determinado pela factorização. Não sendo supervisionada, não se propõe nenhuma relação a priori entre os objectos e/ou as variáveis,
x
σ x
x i
procurando ela própria as relações entre os diferentes parâmetros (objectos e variáveis), permitindo observar eventuais agrupamentos entre objectos ou variáveis
Geometricamente, pode ser compreendida como uma rotação/projecção dos eixos do espaço multivariado de uma matriz, de forma a maximizar a variação ao longo de cada eixo. Estes novos eixos são denominados componentes principais ou variáveis latentes.