Mesures de la biomasse

La mesure de la biomasse est le paramètre le plus important dans le suivi de la croissance

d’une population cellulaire et du déroulement de la fermentation. En effet, le suivi de la biomasse permet d’avoir une idée sur l’état de développement de la culture, sur la masse de

cellules présentes et par conséquent sur la quantité de producteurs potentiels. Les mesures de la biomasse sont difficiles, du fait de la présence dans le milieu de composés insolubles.

Les mesures peuvent être réalisées hors-ligne, sur échantillon après prélèvement, ou en ligne, c’est-à-dire in situ dans le bioréacteur. Différentes techniques existent pour compter les cellules totales ou estimer les cellules vivantes. Il est judicieux d’effectuer plusieurs types de

mesures afin de compiler des informations détaillées sur l’état de la population cellulaire.

6.1. Méthodes pondérales et gravimétriques

6.1.1. Masse fraîche et masse sèche

A partir du milieu contenant les cellules, un échantillon est prélevé puis centrifugé ou

filtré. δa pesée du culot ou du filtre permet de déterminer la biomasse fraîche. A l’issue d’une

étape de dessiccation entre 80 et 100°C, la biomasse sèche est mesurée. Cette technique, simple à

mettre en œuvre, nécessite la maîtrise de l’étape de séchage. Si la dessiccation est trop faible, de l’eau peut rester dans les cellules. Au contraire, si elle est trop forte, les matières organiques

peuvent se volatiliser, entraînant une incertitude sur la mesure. De plus, les particules insolubles du milieu peuvent entraîner une surestimation de la quantité de cellules. Enfin, lorsque la concentration cellulaire est faible, les mesures sont peu précises : il faut alors augmenter le volume de prélèvement, ce qui peut être limitant pour des cultures à l’échelle du laboratoire.

6.1.2. Volume cellulaire

Le volume cellulaire correspond au volume occupé par le culot cellulaire après centrifugation. Cette mesure est très utilisée pour le contrôle des fermentations utilisant des micro-organismes filamenteux. Le prélèvement de milieu est inséré dans un tube gradué puis une

étape de centrifugation permet d’éliminer le surnageant. δe culot obtenu est fonction de la vitesse et du temps de centrifugation. δa difficulté de cette technique réside dans le fait qu’une

calibration par micro-organisme est nécessaire et que les changements morphologiques au cours du procédé de culture peuvent influencer le volume occupé par le culot.

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6.2. Méthodes optiques

6.2.1. Mesures d’une intensité lumineuse

δa mesure d’une intensité lumineuse avant et après passage au travers d’une suspension

cellulaire est une méthode simple pour estimer le nombre de cellules totales (Figure 15). La

limite de ces techniques réside dans le fait qu’à fortes concentrations en biomasse, le signal n’est

plus linéaire.

Figure 15. Principe de mesure de la turbidité par différentes méthodes.

6.2.1.1. Turbidimétrie

La turbidimétrie, ou densité optique, consiste à mesurer la différence entre la lumière

incidente et la lumière transmise. δe signal obtenu, à une longueur d’onde de l’ordre de 600 nm, résulte de la diffusion et de l’absorption de la lumière. δ’information obtenue par cette méthode

est quantitative et non qualitative, aucune distinction n’étant faite entre les cellules vivantes et les cellules mortes. De plus, la couleur du milieu de culture, la présence de particules insolubles ou

d’agrégats cellulaires compliquent la mesure et l’interprétation des résultats.

6.2.1.2. Néphélométrie

La néphélométrie est basée sur le rapport entre la lumière transmise et la lumière diffusée à 90°. La longueur d’onde utilisée dans cette technique, proche de l’infrarouge (κ50 nm), permet

de s’affranchir de l’influence de la couleur du milieu de culture. δes mesures sont réalisées in

situ grâce à des sondes à fibres optiques ou des couples diode-photodiode. Ces sondes doivent être calibrées pour chaque micro-organisme et ne sont pas utilisables pour les organismes filamenteux. De plus, cette méthode est influencée par la présence de particules insolubles.

6.2.2. Comptage cellulaire

Les cellules présentes dans un échantillon peuvent être comptées à l’aide d’un microscope optique, en utilisant un hématimètre. Un hématimètre est une lame comprenant une cavité ou une chambre de profondeur connue. Il en existe différents types dont les principaux sont la cellule de

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Malassez et la cellule de Thomas. Cette technique de comptage donne des informations sur la taille et la morphologie des cellules. Elle permet la numération des cellules totales ou des

cellules vivantes grâce au traitement préalable de l’échantillon avec un colorant spécifique tel

que le bleu de méthylène ou les sels de tétrazolium. δ’inconvénient majeur de cette méthode est le manque de précision, dû aux dilutions et aux prélèvements non homogènes effectués.

D’autres techniques, plus sophistiquées, permettent de compter, trier et dénombrer

automatiquement les cellules. Le compteur Coulter est un appareillage simple dans lequel un

champ électrique est créé entre deux électrodes dont l’espacement est calibré en fonction du

micro-organisme à étudier. δorsqu’une cellule passe l’orifice, la résistance électrique augmente, ce qui génère un signal proportionnel à la taille des cellules. La principale limite de cette

technique est l’absence de distinction entre les cellules vivantes et les cellules mortes. Pour

obtenir des informations sur la viabilité, un cytomètre de flux peut être utilisé. Cet appareil analyse, de façon individuelle, plusieurs caractéristiques des cellules comme par exemple la taille, la forme, le pH, les caractéristiques membranaires, mais aussi la viabilité par traitement des cellules avec des réactifs fluorescents tels que le bromure d’éthidium pour marquer les acides nucléiques, ou l’isothiocyanate de fluorescéine pour marquer les protéines. Enfin, par

l’application d’un champ électrique, les cellules peuvent être triées à l’aide du cytomètre.

6.3. Méthodes physiques

La dégradation des substrats en vue de la synthèse de biomasse est une réaction exothermique : il existe un couplage entre la croissance et le stockage d’énergie sous forme

d’ATP. Un calorimètre à flux de chaleur permet de déterminer, on-line, la relation entre la

cinétique de croissance et le flux de chaleur dégagée. Cette technologie, coûteuse, ne trouve un

intérêt qu’au niveau des laboratoires académiques.

Lorsque le substrat utilisé est un polymère de masse moléculaire élevée ou lorsque le produit est un composé à viscosité élevée, un viscosimètre peut être utilisé pour suivre les changements rhéologiques du milieu au cours de la fermentation. Cette technique trouve également un intérêt pour les cultures à hautes densités cellulaires.

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6.4. Méthodes électrochimiques

Dans les méthodes électrochimiques, un champ électrique est appliqué et différentes

mesures sont réalisées telles que la conductance, l’impédance et la capacitance. Cette technique

est utilisée on-line pour les cultures de cellules en suspension ou immobilisées, et dans le cas de

phénomènes d’adhésion cellulaire. δa principale limite réside dans la quantité importante de

cellules nécessaires pour effectuer la mesure.

6.5. Méthodes biologiques

δ’avantage des méthodes biologiques est leur aptitude à estimer la biomasse viable. La méthode principale est le dénombrement sur milieu solide, de type gélose agarose. A partir d’un prélèvement de milieu, l’échantillon est dilué en série puis déposé sur le milieu nutritif. Après

incubation, une colonie de cellules se développe à partir de chaque clone viable initialement étalé. δ’inconvénient majeur de cette technique est le temps de préparation des échantillons et le

temps d’attente avant le dénombrement des colonies.

Il existe également des méthodes biologiques indirectes de mesures de la biomasse, par le biais de la détermination des composants cellulaires ou des composants du milieu, substrat ou

produit. δ’analyse des composants cellulaires consiste à doser les protéines, les acides nucléiques et l’ATP. δ’intérêt du dosage des protéines est que ces molécules représentent 40 à

65% de la masse cellulaire et que leur proportion est relativement constante et indépendante des conditions de culture. Toutefois, des interférences peuvent avoir lieu si les protéines sont

excrétées dans le milieu et il est parfois nécessaire d’avoir recours à des surfactants pour

solubiliser les protéines membranaires. Dans des cas particuliers de cultures, l’ATP est analysé par dosage enzymatique utilisant la luciférase ou par dosage chromatographique HPLC. Des

techniques immunologiques ou fluorescentes peuvent être mises en œuvre pour déterminer la

biomasse.

Les nutriments peuvent être analysés. Si les réactions bilans sont clairement établies,

l’analyse de la source de carbone ou de la source d’azote permet de déduire la quantité de

biomasse. δa consommation d’oxygène est également un indicateur de la croissance cellulaire.

Enfin, l’analyse des produits formés peut donner une indication notamment le dégagement de

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