Analyse de la croissance et de la productivité

4.5.1. Mesures de biomasse

A partir d’un même prélèvement, différentes méthodes d’analyses sont effectuées pour le

suivi de la croissance.

4.5.1.1. Densité optique

δe suivi de l’évolution de la densité optique à 600nm (DO600nm) de la culture au cours du

temps est effectué sur un spectrophotomètre Lamba bio & bio+ (Perkin Elmer, Etats-Unis). La mesure de DO600nm est réalisée sur deux échantillons minimum, dilués si nécessaire dans de l’eau

purifiée pour respecter la zone de linéarité de l’appareil (0,1 à 0,7). La valeur de DO600nm de

l’échantillon correspond à la moyenne des mesures. δ’analyse de l’évolution de la DO600nm en

échelle logarithmique permet de déterminer les différentes phases de croissance et de calculer les temps de génération (Tg, exprimé en heure) à partir de la lecture graphique du taux de croissance (µmax, exprimé en heure-1) (Equation 5).

Equation 5. Calcul du temps de génération.

�� ℎ = _µ ln 2

� ℎ−1

4.5.1.2. Numération et viabilité sur milieu solide

La viabilité est estimée par étalement sur gélose Sabouraud (Merck KGaA, Allemagne) de

l’échantillon dilué de dixième en dixième dans une solution de NaCl 0,λ% stérile (Aguettant,

France) de sorte à pouvoir distinguer des colonies isolées.

δ’estimation des dilutions à étaler est basée sur la valeur de la DO600nm. Une

correspondance entre les valeurs et les dilutions a été préalablement établie au laboratoire par type de milieu (complexe ou synthétique) et sert d’outil indicateur.

Après incubation, au minimum 4κ heures dans une étuve à γ0°C, le nombre d’unités

formant colonies (UFC) est estimé. δe résultat est exprimé sous forme du nombre d’UFC/mδ de

92 4.5.1.3. Biomasse fraîche et sèche

La mesure de la biomasse fraîche (masse fraîche, MF) et de la biomasse sèche (masse

sèche, εS) est réalisée à partir d’un prélèvement, en doublon, de 1mδ de milieu de culture.

Après centrifugation à 13000rpm pendant 10 minutes (micro-centrifugeuse galaxy 7D Micro2416, VWR, Etats-Unis), le surnageant est éliminé et la masse du culot humide restant est calculée (MF).

A partir du culot humide, un dessiccateur MA100 (Sartorius, Allemagne) va permettre la mesure de la masse sèche selon un programme spécifique. Le culot humide est repris dans de

l’eau purifiée en deux temps et la suspension cellulaire ainsi obtenue est déposée sur une

coupelle pour permettre un séchage homogène. La dessiccation est réalisée par chauffage aux

infrarouges de l’échantillon à 1κ0°C, et s’arrête lorsque la variation de masse est inférieure à

1.10-4g/seconde.

4.5.2. Suivi du pH

Pour le suivi hors-ligne, le pH est mesuré à l’aide d’une électrode Inlab® Expert Pro pH (Mettler-Toledo, Suisse) possédant une sonde de température intégrée. Au cours des étapes de développement du milieu, le nombre de puits par condition est réduit afin de limiter le nombre de plaques à utiliser et donc pour réduire le temps d’expérience. Par conséquent, la vidange des

puits, réalisée pour disposer d’un volume suffisant de milieu pour la mesure du pH, n’est pas

appropriée. Le pH a donc été estimé dans un premier temps par lecture du virement coloré de

100µδ d’échantillon sur papier pH (εerck KGaA, Allemagne), avec des points de contrôles

confirmés par la sonde précédemment citée ; puis il a été mesuré à l’aide d’une micro-électrode couplée à une sonde de température, InLab® Ultra Micro pH (Mettler-Toledo, Suisse), acquise au cours du projet.

4.5.3. Analyse des protéines

δ’identification et la quantification des protéines est réalisée par le laboratoire de contrôle

qualité du site de Martillac qui utilise la méthode Biacore (Figure 37). Cet appareil permet de détecter, en temps réel, les interactions entre les biomolécules et fournit des informations

relatives à la spécificité de l’interaction, à la concentration de molécules initialement présentes et

à la cinétique des phénomènes d’association/dissociation de la molécule avec son ligand. Il est constitué de trois éléments : un biocapteur, comprenant successivement un ligand, une couche de dextrane, une couche d’or et une plaque de verre ; un système de micro-canaux, apportant

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technologie mise en œuvre se base sur le phénomène physique de résonance plasmonique de

surface (SPR). Un faisceau de lumière polarisée monochromatique est envoyé sur une interface

située entre deux milieux d’indices de réfraction différents. Par conséquent, une partie de la lumière incidente se réfléchit sur l’interface tandis que les autres rayons sont réfractés. δa présence d’une fine couche d’or sur cette interface entraîne l’entrée en résonance des électrons

du métal avec les photons du faisceau incident. Ce phénomène se traduit d’un point de vue

énergétique, par une baisse de l’intensité du faisceau réfléchi au niveau d’un angle précis appelé

angle de résonnance. δ’angle de résonance varie en fonction de l’indice de réfraction du milieu :

la détection par l’appareil est basée sur la capacité des molécules se liant spécifiquement à un ligand préalablement fixé sur l’interface, de modifier l’indice de réfraction, modifiant ainsi les

conditions de résonance des ondes plasmoniques de surface. L'enregistrement de la variation de la position de l’angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur.

Figure 37. Principe de la technologie Biacore15.

Le biocapteur utilisé pour la reconnaissance du Nanobody® d’intérêt est la Cε5 (CarboxyMéthyl 5) dont la couche de dextrane est couplée à la protéine A.

15 _{Extrait du cours « Principe de fonctionnement du Biacore », disponible sur la plateforme de cours en ligne}

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