Mesure de l’activité de phagocytose hémocytaire

Pour déterminer l’activité de phagocytose des cellules hémocytaires, nous avons choisi d’utiliser des billes de latex fluorescentes en nous basant sur le protocole de Brousseau

et al., 1998. Cette méthodologie a été fréquemment utilisée pour étudier

l’immunocompétence de mollusques et certains points de méthodologie peuvent varier entre les auteurs (Tableau 2.3). Plusieurs études spécifient le volume d’hémolymphe utilisé pour la mesure de phagocytose sans préciser de concentration hémocytaire utilisée. On supposera que la concentration cellulaire n’est pas déterminée, ce qui ne permet pas d’ajuster le volume de billes ajoutées afin d’avoir un ratio billes : cellules constant.

Nous avons cherché à déterminer les paramètres optimaux pour réaliser la mesure en testant l’effet de plusieurs variables, notamment le temps d’incubation, la concentration cellulaire, le ratio billes/hémocyte ainsi que la taille des billes.

Tableau 2. 3 : Paramètres utilisés d’après la littérature pour mesurer l’activité de phagocytose chez les mollusques à l’aide de billes fluorescentes. ND = non déterminé ; NS = Non spécifié. Référence Temps d’incubation (H) [Cellulaire] cellules mL-1 Taille de bille (µm) Ratio billes / hémocyte Xue et al., 2001 18 ND 1,7 ND Sauvé et al., 2002 18 1x106 1,716 100:1 Gagnaire et al., 2006 a 1 1x106 1 ~220:1 Duchemin et al., 2007 4 ND 2 30:1 García-García et al., 2008 2 NS 1 10:1 Malagoli et al., 2008 0,5 1x105 1 ~450:1

Donaghy et al., 2009a 2 ND 2 ND

Le Foll et al., 2010 2 ND 2 >50:1

Latire et al., 2012 1 ND 1 630:1

- 96 -

II.5.1. Cinétique d’incubation

Deux cinétiques d’incubation ont été suivies au cours de l’expérimentation. Pour chaque cinétique, 4 tubes contenants 50 000 cellules dans 250 µL de milieu à un ratio de 100 billes par hémocyte sont placés à 16°C et analysés après 1, 4, 6 et 18 heures d’incubation. Pour l’une des deux cinétiques un gradient de BSA (3%) est réalisé à chaque temps d’analyse afin d’éliminer une partie des billes surnuméraires. D’un point de vue analytique, un hémocyte est considéré comme phagocytaire lorsqu’il a phagocyté au minimum trois billes (Figure 2.11).

Figure 2. 11 : Histogramme de fluorescence pour la mesure du taux de cellules phagocytaires. La fluorescence est émise par les billes de latex phagocytées après excitation par un laser à 488 nm. Elle est mesurée en cytométrie de flux après 18 heures d’incubation. Le marqueur M1 est positionné sur les hémocytes ayant phagocyté au moins trois billes et permet de déterminer le taux de phagocytose. Le nombre moyen de billes phagocytées est déterminé en divisant la moyenne de fluorescence de M1 par la moyenne de fluorescence de M2 (hémocytes ayant phagocyté une bille).

- 97 -

Résultats et choix protocolaire

A partir des données obtenues, on observe que l’utilisation du gradient de BSA lors des 4 premières heures d’incubation entraîne une différence importante du taux de phagocytose, ce qui suggère qu’une partie des billes n’est pas internalisée sur cette période (Figure 2.12 A). Après 18 heures d’incubation, cette différence n’est plus présente et le plus fort taux de phagocytose mesuré est atteint. Un temps d’incubation de 18 heures a été retenu pour la mesure de phagocytose chez la dreissène. L’observation en microscopie confocale de cellules après 18 heures d’incubation a permis de s’assurer de l’internalisation des billes (Figure 2.13).

II.5.2. Effet du ratio de billes par hémocyte

Afin de déterminer l’influence du ratio de billes par hémocyte sur l’activité de phagocytose, 50 000 hémocytes dans 250 µL de milieu ont été placés en incubation avec des ratios de 100 : 1, 75 :1, 50 :1 et 25 :1 pendant 18 heures à 16°C avant analyse en cytométrie de flux.

Résultats et choix protocolaire

D’après l’analyse des résultats, aucun des ratios testés n’entraîne de différence sur le taux de phagocytose des hémocytes (ANOVA p= 0,067 ; Figure 2.12 B). Cependant, si le nombre moyen de billes phagocytées est considéré, des différences significatives apparaissent pour le plus faible ratio (ANOVA p= 0,032 ; Figure 2.12 B). Pour un ratio compris entre 100 et 50 :1, les billes sont en excès par rapport aux capacités de phagocytose des hémocytes et ne constituent pas un facteur limitant l’activité. Le ratio de 100 :1 a été conservé pour les analyses de phagocytose en cytométrie chez la dreissène.

- 98 -

Figure 2. 12 : Optimisation du protocole de mesure de l’activité de phagocytose des hémocytes chez la moule zébrée. A : Evolution dans le temps du taux de phagocytose : les cellules sont analysées après 1, 4, 6 et 18 heures d’incubation

- 99 -

avec les billes. Pour chaque temps, l’analyse est réalisée avec et sans l’utilisation de gradient de BSA. B : Effet du ratio bille : hémocyte sur le taux de phagocytose et le nombre moyen de billes phagocytées après 18 heures d’incubation. Les cellules ont été placées en incubation avec différents ratio de billes par hémocyte. C : Effet de la concentration cellulaire sur le taux de phagocytose et le nombre moyen de billes phagocytées après 18 heures d’incubation. Différentes concentrations cellulaires ont été placées en incubation avec ratio de billes par hémocyte fixe de 100 :1. D : Effet de la taille des billes de latex sur le taux de phagocytose et le nombre moyen de billes phagocytées après 18 heures d’incubation. Les cellules ont été placées en incubation avec des billes de 1,75 ou 2 µm. Les lettres et les astérisques indiquent les groupes homogènes et les différences significatives entre les conditions testées (ANOVA et Student t-test respectivement). N=6 pour chaque expérimentation et les données sont exprimées en moyenne ± ET.

Figure 2. 13 : Observation en microscopie confocale d’hémocytes après 18 heures d’incubation avec des billes fluorescentes. Le marquage des noyaux a été réalisé au Hoechst 3342 (10 µM).

- 100 -

II.5.3. Effet de la concentration cellulaire

Afin de déterminer l’influence de la concentration cellulaire sur l’activité de phagocytose, des hémocytes à la concentration entre 400 000 et 100 000 cellules.mL-1 ont été mis en contact avec des billes fluorescentes à un ratio 100 :1 pendant 18 heures avant analyse.

Résultats et choix protocolaire

A partir des données obtenues, les résultats indiquent que la concentration cellulaire testée la plus faible (100 000 cellules.mL-1) présente un taux de phagocytose significativement inférieur à la plus forte concentration cellulaire testée (ANOVA

p = 0,036 ; Figure 2.12 C). Aucune différence n’a été observée pour le nombre moyen

de billes phagocytées (ANOVA p = 0,195 ; Figure 2.12 C). Ce phénomène pourrait s’expliquer par une plus faible sécrétion de facteurs opsoniques par les hémocytes, qui aurait pour conséquence une réduction du taux de phagocytose. L’étude de l’opsonisation des particules phagocytaires ne sera pas développée dans ces travaux mais constituent un sujet intéressant dans la compréhension des mécanismes associés à la phagocytose.

Selon les besoins en quantité de cellules pour les expérimentations, la concentration de 400 000 ou 200 000 cellules.mL-1 seront utilisées dans les travaux présentés.

II.5.4. Effet de la taille des billes sur l’activité de phagocytose

Nous avons déterminé l’influence du diamètre des billes fluorescentes utilisées sur l’activité de phagocytose. Pour ce faire, des hémocytes ont été exposés selon les conditions déterminées précédemment à des billes fluorescentes de 1,75 ou 2 µm.

Résultats et choix protocolaire

D’après les résultats obtenus, la taille des billes utilisées pour les expérimentations influence le taux d’hémocytes phagocytaires mesuré ainsi que le nombre moyen de billes phagocytées (Student t-test p = 0.025 ; p = 0.012 respectivement) (Figure 2.12 D).

- 101 -

D’après notre expérience, une augmentation de la taille des billes de 0,25 µm entraîne une réduction du taux de cellules phagocytaire de l’ordre de 10% et une réduction du nombre de billes phagocytées d’environ 40%. Il serait intéressant de pouvoir tester une gamme très large de billes de phagocytose pour déterminer les tailles seuils de billes que les cellules ne pourront pas phagocyter.

Lors de l’achat de ce réactif, les fournisseurs vendent des billes fluorescentes pour une taille nominale donnée mais la taille effective peut être différente selon les lots. En effet, certains fabricants indiquent une variation entre 1 et 5% de la taille effective comparé aux valeurs nominales de taille de billes. Il faut veiller à ne pas changer de lot de billes entre les expérimentations pour limiter au maximum les variations de tailles afin de pouvoir plus facilement comparer les résultats.

II.5.5. Utilisation d’un fixateur de cellule pour analyse ultérieure

D’un point de vue expérimental, il n’est pas toujours possible de réaliser les analyses en cytométrie de flux dès la fin du temps d’incubation. Nous avons déterminé s’il était possible d’utiliser un fixateur de cellules pour réaliser l’analyse ultérieurement. La solution testée est composée de milieu de maintien des cellules avec 0,5% v/v formaldéhyde 37% et 2 g.L-1 de sodium azide. Des échantillons de phagocytose ont été subdivisés en deux lots (N=6). Le premier a été analysé directement après 18 heures d’incubation et l’autre a été fixé, conservé à 4°C et analysé 48 heures après fixation.

Résultats et choix protocolaire

Les résultats indiquent que les analyses réalisées 48 heures après fixation conduisent à des résultats identiques à ceux acquis sur échantillons frais (Student t-test p = 0,320). L’utilisation de cette solution de fixation permet d’échelonner les analyses d’échantillons de phagocytose sur au moins 48 heures.

- 102 -

II.5.6. Utilisation de témoins positifs

Nous avons testé trois conditions pour inhiber le processus de phagocytose. Pour ce faire, 50 000 hémocytes dans 250 µL de milieu L15-15% ont été placés en incubation à 16°C pendant 18 heures pour constituer un témoin. En parallèle, un tube a été incubé à 4°C pour une inhibition par des températures basses. Un troisième échantillon est réalisé en incubant les hémocytes en présence de cytochalasine B, un inhibiteur de polymérisation des filaments d’actine, à la concentration de 10 µg.mL-1

à 16°C. La dernière condition consiste en une incubation des hémocytes avec la cytochalasine B à 4°C.

Les résultats obtenus indiquent que l’utilisation de basses températures (4°C) seul ne constitue pas un inhibiteur efficace de la phagocytose pour les hémocytes de dreissène. L’analyse statistique révèle que cette condition n’est pas significativement différente du témoin bien qu’une forte variabilité soit apparente. La plus forte inhibition est observée pour l’incubation des hémocytes en présence de cytochalasine b à 4°C (Figure 2.14)

Figure 2. 14 : Mesure de l’inhibition de la phagocytose après 18 heures d’incubation des hémocytes à 4°C, en présence de cytochalasine b à 16°C ou 4°C.

- 103 -