B- TENEURS DE CERTAINS METAUX LOURDS DANS LA CHAIR DE V DECUSSATA ET
III. MATERIEL ET METHODES 115
1. Matériel
¾ Eau de mer (estuaire) : les modalités de prélèvements de l’eau de mer, le transport et la conservation des échantillons ont été faites conformément aux directives applicables à la surveillance sanitaire de la qualité de l’eau de mer (OMS, 1977 in KASSAB, 1991).
¾ Coquillage (palourde, coque, couteau et Scrobiculaire) :
Ils sont prélevés à marée basse dans des sachets en plastique. Au laboratoire et avant toute analyse, les coquillages sont débarrassés de leur épifaune par brossage de la coquille sous l’eau courante. Les valves sont ensuite ouvertes prés de la flamme à l’aide d’un couteau
stérile. L’eau inter valvaire ainsi que la chair sont recueillies dans un flacon stérile puis ils sont broyés à l’aide d’un broyeur.
Dans le but d’étudier l’impact des rejets des eaux usées urbaines sur la qualité des eaux superficielles de l’estuaire du Bou Regreg, une étude bactériologique saisonnière, a porté sur deux mollusques lamellibranches : Cardium edule et Venerupis decussata et leurs eaux environnantes, durant la période de novembre 1999 à octobre 2000.
En plus, une comparaison au niveau de la chair de Cardium edule a été faite avec
Venerupis decussata. Les prélèvements d’eau sont réalisés dans les quatre stations : S1, S2, S3
et S4 alors que ceux de Cardium edule et Venerupis decussata sont prélevés dans les stations
S1 et S3. La première station correspond à la zone de traversée entre Rabat et Salé, on y
trouve une activité importante liée à la présence de barcassiers. Cette zone reçoit une grande partie des effluents pollués provenant essentiellement de la ville de Salé. La station S3 est une
zone de marais où il y a un grand rejet d’eaux usées domestiques ; juste quelques dizaines de mètres en amont, se trouve le plus important rejet de l’oued.
100 individus sont récoltés pour chaque espèce, ainsi que les échantillons d’eau au niveau de chaque station, puis sont mis dans des bocaux stérilisés et transportés dans une glacière à 4°C environ au laboratoire de microbiologie de l’Hôpital Avicenne de Rabat où les analyses ont aussitôt été effectuées.
2. Méthodes
Les échantillons d’eau sont soumis à une série de dilutions 10-1 10-2 et 10-3, puis 100 ml
de chaque échantillon sont filtrés sur une membrane millipore 0,45 µm montée sur une rampe de filtration. Les individus sont vidés de leurs coquilles et une prise d’essai de 25g de chair est homogénéisée en contact de 225 ml d’eau peptonnée tamponnée (M1) (annexes tab. XLII) dans un sachet stérile, à l’aide d’un broyeur de type Stomacher (DEJLI, 2000). A partir des suspensions obtenues, on réalise les différents ensemencements.
Les germes recherchés dans cette étude sont donc les germes indicateurs de la qualité hygiénique (les coliformes et les streptocoques fécaux) et les germes pathogènes, à transmission hydrique (Salmonella et le Vibrion cholérique).
Dans l’eau, la membrane de filtration est ensemencée sur gélose lactosée (M3) au TTC et au Tergitol 7 ; l’incubation se fait à 44°C pendant 24-48 heures. Les colonies caractéristiques des coliformes fécaux jaunes ou orangées sont dénombrées.
Pour les individus, les coliformes sont dénombrés sur gélose au désoycholate lactose (M1) en double couche : 1 ml de la suspension préparée est déposé dans une boite de pétrie stérile, on ajoute 13 ml de gélose fondue et ramenée à 47°C. L’ensemble est homogénéisé par un mouvement de rotation de la boite de pétrie puis solidifié à température ambiante. La deuxième couche est ensuite coulée.
L’incubation s’effectue à 37°C pour le dénombrement des coliformes totaux et à 44°C pendant 24 h pour le dénombrement des coliformes fécaux. Les colonies rouge foncé caractéristiques des coliformes d’un diamètre supérieur à 0,5 mm sont dénombrées.
Les streptocoques fécaux sont dénombrés au niveau de l’eau. La membrane de filtration est ensemencée sur gélose de SLANETZ et BBARTHEY. L’incubation s’effectue à 37°C pendant 24-48 heures. Les colonies caractéristiques rouges, marrons ou roses sont dénombrées.
L’étude qualitative donc la recherche des germes pathogènes, à savoir les salmonelles et le Vibrio-cholérique nous conduit à ce que : avant chaque test, les souches suspectes sont repiquées sur gélose nutritive et incubées à 37°C pendant 24 h afin d’avoir une culture en phase exponentielle de croissance des bactéries avec lesquelles on ensemence les différents milieux de culture d’identification.
Pour l’eau, deux litres sont filtrés et la membrane de filtration est ensemencée directement dans le bouillon sélénite de sodium (M.5) et incubée à 37°C pendant 24 heures.
Pour les individus on procède à un préenrichissement dans l’eau peptonnée (M.2) pendant 4 heures à 37°C, et un enrichissement dans le bouillon sélénite de sodium (M.5) à 37°C pendant 24 heures. Les isolements à partir du bouillon sélénite, s’effectue sur gélose SS (Salmonella- Shigella) (M.4). Les colonies incolores et/ou à centre noir sont identifiées selon leurs caractères biochimiques (systèmes automatiques API) et antigénique.
En ce qui concerne le vibrio cholérique pour les échantillons d’eau, la membrane de filtration est ensemencée dans l’eau peptonnée alcaline (M.7) hypersalée et incubée à 37°C pendant 18 heures. Pour les individus, 1 ml de la suspension est ensemencée dans l’eau peptonnée alcaline hypersalée (enrichissement) (M.7) pendant 18 heures à 37°C. Les isolements se font sur gélose TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Saccharose) (M.8). L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures. Les colonies caractéristiques jaunes sont identifiées après examen à l’état frais et coloration de Gram.
La récolte des mollusques lamellibranches (palourdes et coques) paraît être une des activités les plus importantes. Ces espèces sont caractéristiques du milieu marin et vivent dans les sédiments à une profondeur qui atteint fréquemment 20 cm. La récolte se fait habituellement par dragage du fond à marré basse, à l’aide de fourches artisanales tirées au moyen d’un treuil monté dans de petites barques (BEN MESSAOUD, 1987, KOURRADI, 1987 et BEN MESSAOUD et al., 2001b). Elle se fait aussi en plongée sous-marine par une société sur place qui les commercialise.
La méthode d’analyse des données (AFC) nous indique qu’afin de caractériser la richesse bactériologique en coliformes fécaux et streptocoques fécaux du milieu et de chercher s’il y a une relation entre ce type de richesse et le degré de contamination de la chair de Venerupis decussata et Cardium edule. Nous avons, pendant les quatre saisons, évalué ce degré dans les quatre stations (S1, S2, S3, et S4).
Puis, sachant que la qualité physico-chimique de ces stations a été évaluée (cf. chap.I), nous avons également essayé de voir si cette qualité physico-chimique locale du milieu influence la charge bactériologique vis à vis de deux types des germes indicateurs de la qualité hygiénique (CF et SF) et les germes pathogènes à transmission hydrique (salmonella et le vibrion cholérique). Ces derniers n’ont pas été analysés par l’AFC car la recherche s’est avérée négative.
La méthode statistique que nous avons utilisée pour cette étude est l’Analyse Factorielle des Correspondances (A.F.C.). Cette méthode dont les principes mathématiques ont été exposés dans les ouvrages de LERAT et FENELON (1971) in FADLI, 2003 ; BENZECRI
est basée sur l’analyse de corrélation entre les variables, dont la réduction du nombre de caractères se fait par la construction de nouveaux caractères synthétiques ou de nombreux axes factoriels issus de la combinaison linéaire des caractères initiaux.