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1-CADRES
1-1-Cadre institutionnel
L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), constitue notre cadre institutionnel. Elle comporte plusieurs départements dont le département de Génie de Biologie Humaine (GBH), notre département d’origine.
Le département de Génie de Biologie Humaine forme en trois ans, des techniciens en analyses biomédicales.
1-2-Cadre technique
Notre stage s’est déroulé au laboratoire national de santé de Cotonou.
1-2.1- Situation
Le laboratoire national de santé de Cotonou est situé dans l’enceinte du Ministère de la Santé.
1-2-2- Attributions
Le laboratoire national de santé est chargé de :
développer et pratiquer les méthodes d’analyses biologiques dans un but de diagnostic et de recherche ;
organiser et mettre en œuvre toutes les enquêtes de surveillance épidémiologique des maladies en général et des maladies transmissibles en particulier ;
pratiquer toutes les analyses de santé publiqueen collaboration avec les structures concernées ;
assurer l’organisation des stages pratiques des élèves et étudiants en provenance des structures agréées de formation, ainsi que le recyclage et la formation en cours d’emploi des techniciens de laboratoire d’analyses biomédicales ;
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étudier et faire appliquer la règlementation sur les conditions d’ouverture et de fonctionnement des laboratoires d’analyses biomédicales publics et privés ;
organiser et participer aux analyses de santé publique et aux investigations toxicologiques diverses.
La figure N°2 ci-dessous indique l’organigramme du laboratoire national de santé.
Figure N°2: Organigramme du laboratoire national de santé 1-2- 3-Différentes sections
Le laboratoire national de santé de Cotonou comprend les sections suivantes : Bactériologie, Biochimie, Hématologie, Parasitologie et Sérologie.
Service National des Laboratoires de Santé Secrétariat
Division : Laboratoire
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Section de bactériologie
Elle a pour rôle d’assurer le contrôle et la surveillance des maladies à potentiel épidémique. Outre cette activité, les examens suivants y sont réalisés :
examen cytobactériologique des urines ;
examen cytobactériologique des sécrétions cervico-vaginales ;
examen cytobactériologique des sécrétions urétrales ;
examen bactériologique des pus et sérosités;
spermogramme ;
spermoculture ;
coproculture
Section de parasitologie
Les examens suivants y sont pratiqués :
coprologie parasitaire complète ;
recherche d’amibes, kystes, œufs et parasites ;
analyse de la goutte épaisse et réalisation de la densité parasitaire ;
recherche des œufs de bilharzie vésicale ;
recherche de filaires ;
test biologique de grossesse.
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Section de sérologie
Elle s’occupe, comme la section de bactériologie, du contrôle et de la surveillance des maladies à potentiel épidémique. Néanmoins les examens suivants y sont réalisés :
sérodiagnostic de Widal ;
sérodiagnostic de la syphilis ;
sérodiagnostic de la rubéole ;
sérodiagnostic de la chlamydiose ;
sérodiagnostic de la toxoplasmose ;
dosage de l’anticorps antistreptolysine O ;
recherche de l’antigène du virus de l’hépatite B ;
recherche de l’anticorps du virus de l’hépatite C.
Section de biochimie
Les paramètres suivants y sont dosés :
glycémie ;
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On y pratique également l’électrophorèse de l’hémoglobine et l’ionogramme sanguin.
Section d’hématologie
Les examens ci-après sont pratiqués dans cette section :
numération et formule sanguine ;
vitesse de sédimentation ;
numération des réticulocytes ;
temps de saignement ;
temps de coagulation ;
groupage sanguin ABO et facteur rhésus ;
test d’Emmel.
2- MATEREL
2-1- Echantillons de selles
Le matériel biologique est constitué d’échantillons de selles d’enfants âgés de moins de cinq ans.
2-2-Kits de prélèvements de selles
Le kit de prélèvement de selles est composé de pots propres pour le recueil de selles, de sachets pour l’emballage et d’une glacière pour le transport.
2-3- Matériel pour ELISA
Il est constitué de tubes Eppendorf, de portoirs, de micropipettes, de minuterie, de centrifugeuse de paillasse, d’agitateur vortex, de microplaques, de l’eau distillée, de glycérol, de laveur ELISA, de papier hygiénique, de lecteur ELISA et de kits ProSpectRotavirus. Tous les réactifs ont été conservés à +4°C.
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3-METHODE(S)
3-1- Population d’étude
Elle a été constituée de 56 enfants de moins de cinq ans sans distinction de sexe.
3-1-1-Critère d’inclusion
Tout enfant âgé de moins de cinq ans admis à l’hôpital d’Abomey-Calavi pour raison de gastroentérites faites de diarrhées, avec ou sans vomissements comme premier motif de consultations.
3-1-2-Critère d’exclusion
Tout enfant âgé de moins de cinq ans présentant des selles sanguinolentes.
3-2- Prélèvement
Les échantillons de selles ont été prélevés 48 heures au plus tard après l’admission à l’hôpital des enfants pour éviter les infections nosocomiales, dans des pots propres en plastique de 25ml.
Ces échantillons ont ensuite été transportés au Laboratoire National de Santé pour analyses dans une glacière contenant des accumulateurs de froid.
3-3-Recherche de l’antigène VP6
La détermination de la protéine VP6 a été réalisée par la technique ELISA, selon la méthode décrite dans le kit ProSpecTRotavirus commercialisé par Oxoid.
Les différents réactifs du kit ProSpecTrotavirus et les échantillons de selles à tester ont été sortis du réfrigérateur 30 minutes avant la manipulation.
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Une suspension à 10% a été préparée en ajoutant 100µL de selles liquides ou 0,1g de selles solides soit environ la taille d’un petit pois à 900µL du diluant fourni avec le kit.
La suspension a été mélangée à l’agitateur vortex pendant 30 secondes, puis centrifugée à 5000 tours/min pendant 3 min.
Un volume de 100µL de surnageant de chaque échantillon dilué a été ajouté aux différents micropuits suivant une feuille de paillasse pré établie. Un contrôle positif et un contrôle négatif ont toujours été inclus dans chaque série de tests.
Ensuite, 100µL soit deux gouttes du conjugué ont été ajoutés dans chaque micropuits. Le conjugué contient des anticorps polyclonaux spécifiques à la protéine VP6 et conjugués à de la peroxydase.
La plaque a été recouverte et incubée à 22°C pendant 60 +/- 5minutes.
Après incubation, le contenu des micropuits a été déversé où chaque micropuits a été lavé avec une solution tampon de lavage préalablement dilué au 1/10.
Ce processus de lavage a été réalisé 5 fois au total. Après le lavage final, la plaque a été renversée et tapotée sur du papier absorbant pour retirer les dernières traces de tampon de lavage.
Après ce lavage, 100µL de substrat ont été ajoutés dans chaque micropuits. Le substrat est un chromogène qui permet de révéler la réaction.
Les micropuits ont été ensuite incubés à 22°C pendant 10 minutes, et reçoivent 100µL de solution d’arrêt. La lecture au spectrophotomètre a été effectuée dans les 30 minutes qui ont suivi l’ajout de la solution d’arrêt.
La lecture a été faite à partir d’un lecteur ELISA en double longueurs d’onde 450 et 650 nm. La propreté du fond des micropuits a été soigneusement vérifiée avant la lecture.
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Le calcul de la valeur seuil ou le «Cut-off value» a été fait en ajoutant 0,200 unités d’absorbance à la valeur du contrôle négatif, selon les recommandations du fabricant et approuvées par les laboratoires de références de l’OMS.
Le test a été validé si la valeur du contrôle négatif est strictement inférieure à 0,150 unités d’absorbance et celle du contrôle positif, strictement supérieure à 0,500 unités d’absorbance.
A l’issu de la lecture, tout échantillon de selles dont la valeur d’unité d’absorbance est supérieure à la valeur seuil est positif, et tout échantillon de selles dont la valeur d’unité d’absorbance est inférieure à la valeur seuil est déclaré négatif. Les échantillons dont les résultats ont donné des valeurs d’unités d’absorbance se situant à moins de 0,010 unités d’absorbance de la valeur seuil ont été considérés comme équivoque. Ces échantillons ont été à nouveau testés, ou le patient a été soumis à de nouveaux prélèvements.
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CHAPITRE III