Chapitre III. Étude de l’efficacité de trois HE de thym dans
III.2- MATERIEL ET METHODES
III.2.1- CHOIX ET PREPARATION DES ECHANTILLONS DU BOIS
Les arbres de pin d’Alep provenant de la région de Machraa Kettan dans la forêt de Mamoraont été utilisés pour la préparation des éprouvettes de bois. Les opérations de sciage se sont déroulées au Centre Recherche Forestière de Rabat.
A partir de planches centrales du bois de pin d’Alep, stabilisées à 20°C et 65% d’humidité, une série d’éprouvettes de dimensions de 50x25x15 mm selon les axes longitudinal, radial et tangentiel (L, R, T) ont été confectionnées selon les normes en vigueur (EN 113). Les éprouvettes sont exemptes de discoloration, de pourriture, de trous d’insectes et d’autres défauts et les cernes inclinés de 45° ± 15° par rapport aux arrêts dans le sens tangentiel (figure 10). Quarante échantillons d’aubier de pin sylvestre ont été préparés dans les mêmes conditions et avec les mêmes dimensions.
La répartition des éprouvettes de bois par lot est comme suit :
- L1 : 10 éprouvettes de pin d’Alep ont été utilisées pour la détermination de l’humidité et de la masse anhydre initiale théorique ;
- L2 : 30 éprouvettes pour détérminer la durabilité naturelle de pin d’Alep, à raison de 10 éprouvettes par champignon ;
- L3 : 10 éprouvettes d’aubier de pin sylvestre pour la détermination de l’humidité et la masse sèche théorique de l’essence de contrôle de virulence ;
- L4 : 30 éprouvettes d’aubier de pin sylvestre pour déterminer la virulence des champignons, à raison de 10 éprouvettes par champignon (contrôle de virulence) ;
L5 : 24 éprouvettes de pin d’Alep, à raison de 4 éprouvettes par concentration en HE de T. capitatus pour déterminer la durée du traitement. Ces résultats sont extrapolés aux autres HE, considérant que la cinétique d’absorption et la même pour les quatre HE.
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- L6 : 288 éprouvettes de pin d’Alep (tableau 14), à raison de 4 éprouvettes par champignon et par concentration d’huiles essentielles (test d’efficacité des huiles essentielles) y compris la concentration 0 (solvant seul).
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Tableau 14. Répartition des éprouvettes de test d’efficacité (L6) des HE.
Nombre d’éprouvettes
Type de traitement
v/v
G. trabeum C. puteana P. placenta
12 0 4 4 4 12 1/250 4 4 4 12 1/500 4 4 4 12 1/1000 4 4 4 12 1/2000 4 4 4 T . ca p it a tu s 12 1/3000 4 4 4 12 0 4 4 4 12 1/250 4 4 4 12 1/500 4 4 4 12 1/1000 4 4 4 12 1/2000 4 4 4 T . ci li a tu s 12 1/3000 4 4 4 12 0 4 4 4 12 1/250 4 4 4 12 1/500 4 4 4 12 1/1000 4 4 4 12 1/2000 4 4 4 T . zy g is 12 1/3000 4 4 4 12 0 4 4 4 12 1/250 4 4 4 12 1/500 4 4 4 12 1/1000 4 4 4 12 1/2000 4 4 4 T . b le ic h er ia n u s 12 1/3000 4 4 4 Sous Totaux 96 96 96 Total 288
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III.2.2- CONDITIONNEMENT ET PESEE DES EPROUVETTES DE BOIS
Toutes les éprouvettes sont maintenues à 20°C et 65% d’humidité relative (HR) dans une enceinte de conditionnement, jusqu’à stabilisation de leurs poids. Les éprouvettes sont ensuite numérotées et pesées à 0,01 g près pour déterminer leurs masses humides (Mi).
10 éprouvettes de pin d’Alep (L1) et 10 autres de pin sylvestre (L3) dont la masse humide a été préalablement déterminée (mi), sont maintenues dans l’étuve à 103°C pendant 24 h (jusqu’à stabilisation de leurs masses). Ces éprouvettes sont refroidies dans un dessiccateur et pesées au 0,01 g près pour déterminer leur masse sèche (mf) et calculer leurs humidités. Nous considérons que l’humidité est la même pour toutes les éprouvettes d’une même essence. La masse anhydre, ainsi déterminée, servira pour calculer la masse anhydre initiale théorique des éprouvettes exposées aux champignons, notamment, les éprouvettes de durabilité naturelle, de contrôle de virulence et de test d’efficacité des HE. Ces éprouvettes ne seront plus utilisées par la suite.
Le pourcentage moyen d’humidité des éprouvettes est :
m
i-m
f
U = --- x 100
(Equation 1)m
fLa masse sèche théorique de chaque éprouvette avant essai :
100 Mu
Mt0 = ---
(Equation 2)100+U
Où :
Mto est la masse sèche théorique, exprimée en gramme, des éprouvettes d’essai ;
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Mu est la masse exprimée en gramme des éprouvettes après conditionnement ;
U est le pourcentage moyen d’humidité des éprouvettes d’essai après conditionnement.
De cette formule en déduit un facteur K qui sera utilisé dans le calcul de la masse sèche théorique et des pertes de masse par la suite.
100
K = ---
(Equation 3)100+U
III.2.3- LE MATIÈRIEL FONGIQUELes espèces fongiques utilisées appartiennent à la mycothèque du Laboratoire de Botanique de la Faculté des Sciences de Rabat(tableau 15). La virulence de ces souches vis-à-vis d’un bois naturellement non durable doit être vérifiée sur une essence référence : l’aubier de pin sylvestre naturel. Pour que le champignon soit considéré comme suffisamment virulent, il faut que la perte de masse obtenue par attaque des bois de référence soit supérieure à 20%, une valeur spécifiée dans les normes.
Ces souches sont régulièrement entretenues par repiquage sur un milieu nutritif.
Tableau 15. Souches fongiques utilisées pour les essais de dégradation du
bois de pin d’Alep
Champignon Classification Type de pourriture
Coniophora puteana
(Schumacher ex Fries) Karsten Basidiomycète Bolétale Gloeophyllum trabeum
(Persoon ex Fries) Murrill Basidiomycète Gloeophyllale Poria placenta(Fries) Cooke
sensu J. Eriksson Basidiomycète Polyporale
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III.2.4- PREPARATION DU MILIEU DE CULTURE
Toutes les manipulations sont effectuées dans des conditions stériles. Le matériel et les milieux de culture sont stérilisés par autoclavage. Les repiquages et inoculations sont effectués sous une hotte à flux laminaire. Le milieu de culture utilisé est le malt gélosé composé de :
- L’extrait de malt sous forme de poudre: (40 ± 0,5) g. - L’agar ne provoquant pas d'inhibition de la croissance de champignons: (30 ± 0,5) g.
- L'eau distillée, la quantité suffisante pour 1000 ml.
Le milieu de culture est préparé par réchauffement du mélange dans un bain marie, en agitant jusqu'à dissolution complète. Le milieu est ensuite stérilisé à autoclave à 121°C pendant 20 minutes. Ce 1er milieu sert à couler les boites de pétri citées après.
III.2.4.1- Repiquage des souches fongiques dans les boites de Petri
A partir des cultures mères de Coniophora puteana, Gloeophyllum
trabeum et Poria placenta maintenues dans des tubes stockés au réfrigérateur
à 4°C. Nous avons procédé à des repiquages successifs des champignons dans des boites de Petri stériles contenant le milieu de culture (malt gélosé) stérilisé, afin d’activer ces souches et de préparer la matière fongique suffisante pour nos tests.
III.2.4.2- Préparation des milieux et des flacons de culture
Dans des flacons en verre nous avons versé le milieu de culture (malt gélosé) pour obtenir une épaisseur de 3 à 4 mm. Les flacons sont bouchés avec du papier aluminium et stérilisés par autoclave à 121°C pendant 20 minutes. Les bouchons des flacons sont enrobés dans le papier aluminium et stérilisés dans les mêmes conditions. Une fois retirés de l’autoclave, les flacons sont maintenus sous la hotte en position horizontale (figure 11).
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Figure 11. Préparation des milieux de culture dans les flacons
III.2.4.3- Ensemencement des flacons de culture
Une fois les souches fongiques développées dans les boites de Petri, nous découpons à partir de ces tapis mycéliens, des fragments de mycélium d’environ 1cm2 de diamètre que nous avons déposé à l’intérieur des flacons de culture préparé auparavant. A raison de deux inoculas par flacon (figures 12 et 13).
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Figure 13. Développement de Gloeophylum trabeum dans un flacon
de culture
III.2.5- PREPARATION DES PRODUITS DE TRAITEMENT DU BOIS ET DES EPROUVETTES AVANT TRAITEMENT
Dans ce test, nous avons utilisé les huiles essentielles de quatre thyms :
T. capitatus, T. ciliatus, T. zygis et T. bleicherianus. Ce sont les mêmes HE
dont nous avons déterminé la composition chimique et l’activité antifongique dans ce travail.
Du fait de la non miscibilité des HE dans l’eau, la dilution a été réalisée dans un solvant, le xylène. Des dilutions (1/250, 1/500, 1/1000, 1/2000 et 1/3000 v/v) ont été préparées à partir des HE de T. capitatus, T. ciliatus et T.
zygis et T. bleicherianus. Le choix de ces dilutions a été fait sur la base des
résultats de l’activité antifongique des HE in vitro et des tests préliminaires de l’efficacité de ces essences dans la préservation du bois de pin d’Alep.
Un solvant témoin (xylène), c'est-à-dire un traitement à la concentration 0 est également inclus dans chaque série d'essais.
Le traitement des éprouvettes a été effectué par trempage (au lieu du procédé d’imprégnation décrit dans la norme EN 113) pendant 1h30mn, dans le xylène contenant des concentrations différentes d’HE étudiées.
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La durée de trempage des éprouvettes dans le solvant contenant l’HE a été déterminée auparavant par des tests préliminaires sur 32 éprouvettes (L5), c’est la durée suffisante pour que la masse des éprouvettes trompées dans la solution de traitement devienne stable.
Pour chaque HE et pour chaque concentration, les éprouvettes du lot (L6) sont séchées dans des récipients en verre à l’étuve à 103°C pendant 24 heures. A la fin du séchage, les récipients sont enrobés dans du papier aluminium pour empêcher le bois d’absorber l’eau et l’humidité de l’air, ils sont ensuite refroidis à température ambiante, et puis stérilisés en autoclave. Nous avons séché les éprouvettes du fait que les solvants pénètrent dans le bois tout en entraînant le produit de préservation.
Les lots d’éprouvettes séchées et stérilisées, sont déposés dans des récipients de façon que leur plus grande partie soit en contact avec le liquide de traitement, puis on verse dans chaque récipient la dilution d’HE à tester, un poids est également appliqué sur les éprouvettes pour les empêcher de flotter à la surface du liquide. Le traitement a duré 1h30mn.
Les éprouvettes d’essai sont stérilisées avant le traitement aux HE. Habituellement, on traite les éprouvettes, puis quand elles sont sèches, on les stérilise, parce que, si on stérilise les éprouvettes traitées avec HE de thym, on fait partir la grande majorité des substances volatiles.
III.2.6- CONDITIONNEMENT DES EPROUVETTES APRES
TRAITEMENT
Après traitement des éprouvettes, l’excès du solvant est retiré des récipients, ces derniers sont fermés et déposés dans la chambre de conditionnement à 20°C et 65% HR pendant une semaine, et sont ensuite ouverts par des trous dans lesquels sont placés des morceaux de coton et maintenus dans l’enceinte de conditionnement pendant trois autres semaines.
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III.2.7- EXPOSITION DES EPROUVETTES AUX CHAMPIGNONS
L'exposition aux champignons a lieu dès que le mycélium recouvre entièrement la surface du milieu de culture. Cela correspond à la phase active de développement qui ne doit en aucun cas dépasser le délai de quatre semaines. Les champignons doivent être exempts de contamination par d'autres organismes.
Une fois le mycélium ayant atteint cet état de développement, nous introduisons aseptiquement à l’aide d’une pince, dans chaque flacon de culture quatre supports en verre de 3 mm d’épaisseur, préalablement stérilisés. Puis nous déposons aseptiquement, à l’aide d’une pince sur chaque paire de support une éprouvette au milieu du flacon. Les éprouvettes traitées par la même HE et la même concentration sont déposées dans le même flacon ; à raison de deux éprouvettes par flacon.
Les éprouvettes qui ont servi pour déterminer la durabilité naturelle de pin d’Alep (L2) et les éprouvettes de contrôle de virulence (L4) ont passé par les mêmes étapes que celles traitées, stérilisées et stabilisées dans les mêmes conditions. Cependant elles n’ont pas été séchées ni traitées par le solvant contenant les huiles essentielles.
Les flacons sont ensuite fermés avec un couvercle troué au centre, dans lequel est placé un bouchon en coton, puis déposés pendant une durée de 16 semaines dans une salle de culture à 20°C et 70% HR.
III.2.8- EXAMEN DES EPROUVETTES ET EVALUATION DE L’ESSAI
À la fin de l'essai, nous retirons les éprouvettes des flacons de culture. Le mycélium accumulé à la surface des éprouvettes est enlevé à l’aide d’un pinceau à poil dur. Les échantillons sont immédiatement pesés à l’état dégradé humide (Mi). Les échantillons sont à nouveau séchés en étuve à 103°C pendant 24 h et leurs masses anhydres sont mesurées (Mf).
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III.2.9- CALCUL DE LA PERTE DE MASSE PROVOQUEE PAR L'ATTAQUE DES CHAMPIGNONS
La dégradation est évaluée par le pourcentage de perte de masse anhydre (P) du matériau qui se calcul par la relation :
Mt-Mf
P = ---
(Equation 4)Mf
Avec Mt : masse anhydre initiale théorique Mf : Masse anhydre en fin d’essai
Les résultats représentent la valeur moyenne de P sur les échantillons utilisés par champignon et par traitement. P permet de déterminer la classe de durabilité du bois.
III.3- RESULTATS ET DISCUSSION
III.3.1-DETERMINATION DU POURCENTAGE MOYEN
D’HUMIDITE ET COEFFICIENT DE CORRECTION
D’HUMIDITE
Le but de cette étape est la détermination de la masse anhydre théorique des éprouvettes de durabilité naturelle (L2), de contrôle de virulence (L4) et de test d’efficacité des HE (L6), exposées aux champignons, et dont la masse anhydre n’a pas été déterminée directement, pour éviter les risques de contamination pendant le pesage des éprouvettes à la balance.
Les résultats du pourcentage moyen d’humidité et du coefficient de correction d’humidité K pour les éprouvettes de pin d’Alep et d’aubier de pin sylvestre sont présentés dans les tableaux 16 et 17.
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Tableau 16. Pourcentage moyen d’humidité et coefficient de correction d’humidité K pour les éprouvettes de pin d’Alep.
Coefficient de correction d’humidité K
N° éprouvette Masse humide
(g) Masse anhydre (g) Humidité (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9,957 10,312 10,624 10,548 10,072 10,581 10,408 9,983 10,396 9,833 8,904 9,372 9,463 9,501 8,97 9,454 9,355 8,943 9,402 8,695 11,83 10,03 12,27 11,02 12,29 11,92 12,26 11,63 10,57 13,09 Somme 102,714 92,059 Moyenne 11,59 K 0,896
Tableau 17. Pourcentage moyen d’humidité et coefficient de correction d’humidité K pour les éprouvettes d’aubier de pin sylvestre.
Coefficient de correction d’humidité K
N° éprouvette Masse humide
(g) Masse anhydre (g) Humidité (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10,516 10,189 9,891 11,112 9,986 10,284 9,913 10,388 9,743 9,844 9,519 9,168 8,826 10,002 8,974 9,300 9,893 9,352 8,781 8,846 10,47 11,14 12,07 11,10 11,28 10,58 11,47 11,08 10,96 11,28 Somme 101,866 91,661 Moyenne 11,14 K 0,897
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III.3.2- DETERMINATION DE LA DURABILITE NATURELLE DES EPROUVETTES
La durabilité naturelle du bois de pin d’Alep a été déterminée en parallèle avec les essais d’efficacité des huiles essentielles dans la préservation du bois, c’est la référence qui nous permet de déterminer l’efficacité des traitements étudiés dans l’amélioration de la durabilité du bois de pin d’Alep.
La durabilité naturelle a été déterminée par exposition de 30 éprouvettes de pin d’Alep non traité (L2) à Gloeophyllum trabeum,
Coniophora puteana et Poria placenta, à raison de 10 éprouvettes par
champignon.
Les résultats représentent la valeur moyenne de perte de masse (Pt) sur les 10 échantillons utilisés par champignon. Pt permet de déterminer la classe de durabilité naturelle du bois. Selon la norme NF EN 350-1 (AFNOR 1994a). Les classes de durabilité naturelle du bois sont présentées dans le tableau 18.
Tableau 18. Classes de durabilité naturelle du bois vis-à-vis des champignons
basidiomycétes selon EN 350-1
Classe de
durabilité Descriptif Valeur de P (%)
1 Très durable P ≤ 5
2 Durable 5 < P ≤ 10
3 Moyennement durable 10 < P ≤ 15
4 Faiblement durable 15 < P ≤ 30
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Selon cette norme, le bois de pin d’Alep est donc classé non durable vis-à-vis de G. trabeum et de C. puteana et faiblement durable vis-à-vis de P.
placenta (figure 14). Toutefois ces résultats ne peuvent être confirmés que si
les champignons lignivores testés sont suffisamment virulents. Le contrôle de virulence a été réalisé sur les éprouvettes d’aubier de pin sylvestre (L4) exigé par la norme EN 113. La valeur de perte de masse (Pc) correspond à la moyenne de perte de masse des 10 échantillons de pin sylvestre utilisés par champignon (tableau 19).
Figure 14. Perte de masse moyenne des éprouvettes de pin d’Alep (Pt) (durabilité naturelle)
Perte de masse des éprouvettes de pin d'Alep (durabilité naturelle) 22,86% (3,91) 31,98% (2,88) 44,48% (3,32) 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% 50%
G. trabeum C. puteana P. placenta
P e rt e d e m a s s e ( % ) Non durable F. durable Durable Très durable M. durable
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Tableau 19. Perte de masse moyenne (Pc) des échantillons de pin sylvestre (L4) (contrôle de virulence)
Perte de masse obtenue
(%) Spécification (norme EN 113)
Poria placenta 26,22 ± 3,01 > 20%
Coniophora puteana 33,89 ± 3,67 > 20%
Gloeophyllum trabeum 45,24 ± 3,12 > 20%
Les résultats montrent que l’aubier de pin sylvestre est suffisamment dégradé par G. trabeum, C. puteana et P. placenta. Les valeurs moyennes de perte de masse (Pc) obtenues sont toutes supérieures à 20%, ce qui explique que les trois champignons lignivores utilisés dans nos tests sont suffisamment virulents. Par conséquent les essais effectués avec ces souches fongiques sont totalement valides.
Après avoir déterminé la durabilité des éprouvettes de contrôle de virulence, les résultats de durabilité naturelle de pin d’Alep peuvent être
vérifiés par le facteur
X
selon la norme EN 113 (tableau 20).Pt
X = ---
Pc
Tableau 20. Classes de durabilité naturelle du bois massif vis-à-vis des
champignons lignivores selon les essais de laboratoire (EN 113).
Classe de durabilité Descriptif Valeur de x
1 Très durable x ≤ 0,15
2 Durable 0,15 < x ≤ 0,30
3 Moyennement durable 0,30 < x ≤ 0,60
4 Faiblement durable 0,60 < x ≤ 0,90
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A partir des valeurs de
X
(figure 15) obtenues pour les trois champignons lignivores et selon la norme (EN 113), nous pouvons conclure que le boisde pin d’Alep est donc classé non durable vis-à-vis de G. trabeum et de C. puteana et faiblement durable vis-à-vis de P. placenta ; ces résultats sont comparables à ceux déduits au dessus en appliquant la norme (EN 350- 1). Nos résultats sont similaires à ceux trouvés par Janah (2005).Le boisde pin d’Alep appartient à la classe 5 vis-à-vis des champignons lignivores, ce niveau de durabilité lui permet d’accéder à la classes de risque d’attaque biologique 1 pour une utilisation finale sans traitement.
Figure 15. Durabilité naturelle du bois de pin d’Alep selon les essais de laboratoire (EN 113).
III.3.3- RESULTATS DU TRAITEMENT PAR LES HE
Les éprouvettes de bois de pin d’Alep traitées par trempage dans le xylène contenant des concentrations d’huiles essentielles de Thymus
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1/2000, 1/1000, 1/500 et 1/250 v/v, sont confrontées à l’attaque de trois champignons de pourriture du bois (G. trabeum, C. puteana et P. placenta), à raison de quatre éprouvettes par concentration et par espèce fongique.
III.3.3.1- Résultats du traitement par les HE de Thymus capitatus
Les valeurs de perte de masse des éprouvettes de bois de pin d’Alep traitées par le solvant seul connaissent une diminution très faible (figure 16) qui correspond à une amélioration non significative de la durabilité du bois, le solvant seul exerce un effet relativement faible sur le bois de pin d’Alep.
De même le traitement du bois de pin d’Alep avec des concentrations en huile essentielle de T. capitatus de 1/3000, 1/2000 et 1/1000 v/v, n’affecte pas la classe de durabilité du bois, le bois de pin d’Alep traité avec ces concentrations reste toujours non durable vis-à-vis de G. trabeum et de C.
puteana et faiblement durable vis-à-vis de P. placenta. Cependant l’effet des
concentrations de 1/500 et 1/250 v/v de l’HE T. capitatus sur la durabilité du bois de pin d’Alep est remarquable, ces deux concentrations entraînent une diminution importante de la valeur de la perte de masse des éprouvettes de bois soumis à l’attaque de G. trabeum, de C. puteana et de P. placenta. Ce qui explique une amélioration importante de la durabilité du bois. Ainsi, le bois de pin d’Alep classé non durable vis-à-vis de G. trabeum et de C.
puteana et faiblement durable vis-à-vis de P. placenta devient durable à partir
de la concentration de 1/500 v/v et très durable à partir de 1/250 v/v vis-à-vis des trois espèces fongiques. Le traitement du bois de pin d’Alep avec une concentration de 1/500 v/v de HE de T. capitatus produit une perte de masse des éprouvettes de l’ordre de 7,27, 5,89 et 6,19% vis-à-vis de G. trabeum, C.
puteana et P. placenta respectivement. Le traitement contenant une
concentration de 1/250 de cette essence provoque des pertes de masse moyennes de 1,63, 2,67, et 2,73% vis-à-vis de G. trabeum, C. puteana et P.
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d’efficacité d’un traitement par l’HE de T. capitatus pouvant engendrer une protection suffisante du bois de pin d’Alep contre les champignons de pourriture brune est de 1/500 à 1/250 v/v (tableau 21, page 131).
Figure 16. Variation de la perte de masse des éprouvettes de bois de pin d’Alep traitées par les HE de T. capitatus vis-à-vis de G. trabeum, C. puteana et P. placenta.
III.3.3.2- Résultats du traitement par les HE de Thymus ciliatus
Le traitement des éprouvettes de bois de pin d’Alep par trempage dans le solvant contenant des concentrations allant de 1/3000 à 1/250 des HE de T.
ciliatus, a montré que cette HE exerce un effet inhibiteur important sur la
croissance de G. trabeum, C puteana et P. placenta, et par conséquence sur la
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 M o y e n n e d e p e rt e d e m a s s e e n % D· Naturelle Solvant 1/3000 1/2000 1/1000 1/500 1/250 Concentration en HE (V/V)
Variation de la moyenne de perte de masse des éprouvettes de bois de pin d'Alep en fonction de la concentration de HE de T capitatus
GT CP PP Non durable F. durable Durable M. durable T. durable
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durabilité des éprouvettes traitées par cet extrait vis-à-vis de ces trois champignons. Les résultats de pertes de masse des éprouvettes de bois de pin d’Alep traitées par T. ciliatus vis-à-vis de G. trabeum, C puteana et P.
placenta sont présentés dans le tableau 21.
Pour des concentrations de 1/3000 et 1/2000, l’effet de HE de T.
ciliatus est faible voir négligeable sur la perte de masse du bois de pin d’Alep
vis-à-vis de G. trabeum, C puteana et P. placenta (figure 17). Les variations de perte de masse enregistrées sont faibles et n’affectent pas la durabilité naturelle du bois qui garde la même classe de durabilité que le bois non traité. Le traitement devient efficace à partir de la concentration en HE de 1/1000, les pertes de masse enregistrées à cette concentration sont très faibles de