Matériels et méthodes

4.1 Echantillonnage

Les échantillons proviennent fournisseurs ou producteurs très diérents. Les huiles essen-tielles extraites au laboratoire sont issues de fruits provenant de commerce tels que Monoprix, Carrefour, Biocoop, La vie claire. un lot de citrons et de mandarines et deux lots de bergamotes ont été obtenus de producteurs d'huile essentielle. Enn, l'INRA de Corse nous a fait parvenir des huiles essentielles de citrus issues de leurs propres cultures et obtenues par centrifugation des zestes.

A partir de cet échantillonnage, nous avons identié des échantillons authentiques appelés références. Ces échantillons proviennent, la plupart du temps, directemment de producteurs, car ce sont les sources plus sûres. De plus, pour les huiles essentielles de lavandes, une collaboration avec un producteur a été mis en place, an de abiliser les approvisionnement. De la même manière, dans le cadre de l'étude des huiles essentielles de citrus, des fournisseurs ont collaboré dans le but d'obtenir un échantillonage able.

Ces échantillons ont été produits à des périodes de récolte variées de 2009 à 2012, de ma-nière à ce qu'ils constituent un échantillonnage représentatif. Ils correspondent en tout point à la norme AFNOR (sauf exception) et ils ne doivent pas présenter de résultats suspects pour les analyses chirales ou isotopiques. Les autres échantillons sont désignés comme échantillons commerciaux.

An de créer des modèles statistiques et d'interpréter les résultats des échantillons com-merciaux, des échantillons ont été adultérés au laboratoire. Ainsi, quand cela est pertinent, des additions de 5-10-20 % ont été eectuées sur des huiles essentielles de citrus :

 huile essentielle d'orange issue de l'expression ou de l'hydro-distillation. L'ajout de

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 88

pènes d'orange a été calculé théoriquement dans des huiles essentielles de mandarine et citron.

 huile essentielle d'agrume hydro-distillée, d'huile essentielle de citron, de lime

Aux échantillons de bergamote et lavande, 5 ou 8 %d'huile essentielle de ho wood ont été ajoutés.

L'ajout d'huile essentielle de ho wood acétylée a été calculé théoriquement par ajout de 5 %de linalol et 8 %d'acétate de linalyle.

Ensuite en complément, des ajouts de diverses teneurs (Annexe 1) de linalol, d'acétate de linalyle, de citral, d'acétate de géranyle ainsi que de NMAM ont été eectués sur des échantillons authentiques d'origine Italie mais aussi Espagne ou Côte d'Ivoire dans le cas de l'huile essentielle de citron. Enn, selon la publication de E.M. Gaydou, J.P Bianchini, and R.P Randriamiharisoa [7], des coupes théoriques ont été calculées à partir d'un prol d'huile essentielle d'orange contenant 1300 ppm de PMF, an de pouvoir comparer ces résultats à ceux des échantillons commerciaux. En eet, l'échantillonnage d'huile essentielle d'orange dont nous disposions ne contenait que des huiles essentielles plus riches en PMF.

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 89

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CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 99

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 100

Codes échantillons de ho wood

Les fruits ont été extraits des manières suivantes :

Extraction par solvants :

Les zestes de fruit sont placés dans un bécher de 500 mL avec 300 mL d'un mélange pentane/éther 80/20. Le mélange est ensuite placé sous agitation magnétique puis ltré et ensuite évaporé à 60°C à pression atmosphérique. L'opération est répétée trois fois an d'obtenir un meilleur rendement.

Hydro-distillation :

Les zestes de fruits ont été placés dans un ballon rempli d'eau portée à ébullition. La vapeur d'eau entraine les molécules volatiles qui sont condensées dans le réfrigérant à eau, puis collec-tées dans une ampoule à décanter. La distillation des zestes est maintenue pendant minimum 1h après le début de l'ébullition.

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 101

Figure 4.1: Schéma du matériel expérimental pour la distillation des zestes d'agrumes

4.2 Préparation d'échantillons

Un fractionnement sur gel de silice est nécessaire pour purier ou concentrer certains échan-tillons. Ainsi les analyses énantiomériques des terpènes, du citronnellal, du linalol et de l' a-terpinéol des citrus nécessitent une purication préalable, an de réduire le risque de coélution et d'éliminer les composés lourds pouvant endommager les colonnes chirales, qui ne sont pas des colonnes greées. Ce n'est pas le cas pour les analyses du linalol et acétate de linalyle dont l'importante concentration dans les échantillons permet l'analyse sans purication préalable.

L'énantiomère S de l'acétate de lavandulyle est masqué par la présence de terpinène-4-ol. Le fractionnement sur silice est donc requis.

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 102

Fractionnement sur silice : chromatographie ash

Les solvants sont adaptés selon l'huile essentielle étudiée et le type de fractionnement souhaité. Mode opératoire :

Figure 4.2: Schéma d'une ampoule à décanter utilisée comme colonne de séparation de chromatogra-phie ash

Le solvant, suivant sa polarité, élue plus ou moins les molécules. Il est donc adapté à la séparation voulue. Il convient aussi d'ajuster la quantité de solvant au fractionnement désiré et à la quantité d'échantillon de départ à purier. Le fractionnement est eectué sur gel de silice (chroma gel 200  400 Mesh) placé dans une ampoule à décanter en verre. La méthodologie est développée avec un volume de silice et de solvant xe.

Ce fractionnement n'inuence pas l'excès énantiomérique, mais peut en revanche entrainer un fractionnement isotopique. En eet si la totalité de la molécule n'est pas extraite, le rapport isotopique est modié car l'élution de l'isotope lourd est privilégiée.

Les diérents éluants utilisés sont, purs (distillés au laboratoire) ou en mélange, par ordre de polarité, le pentane, le dichlorométhane, l'éther, et le méthanol. Le choix de ces éluants permet d'obtenir avec une relative précision, quatre fractions diérentes :

 apolaire (terpènes, sesquiterpènes. . .)  moyennement polaire (aldéhydes, esters)  polaire (alcools)

 très polaire (polyols, PMF)

Dans le tableau suivant sont synthétisées les conditions expérimentales pour obtenir le frac-tionnement souhaité.

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 103

Table 4.1: Conditions expérimentales utilisées lors des diérentes purications

Les fractions sont collectées dans des ballons de volume adapté, puis évaporées à pression atmosphérique à 60°C, à l'exception du méthanol (PMF) qui nécessite le vide (trompe à eau). Le résidu est repris avec 1 mL d'hexane ou d'acétone pour les PMF. Concernant le NMAM, le but est d'obtenir un extrait concentré. L'évaporation de la totalité du solvant s'eectue donc successivement dans des ballons de taille de plus en plus réduite an de limiter la perte de résidu et la quantité de solvant nécessaire à la récupération de la fraction.

4.3 L'analyse en GC-FID

La chromatographie en phase gazeuse associée à un détecteur à ionisation de amme (GC-FID) est l'outil utilisé pour l'identication des composés volatils constituant l'huile essentielle. Les molécules sont identiées par indices de rétention (cf chp 2.1).

Les appareils utilisés sont deux GC-FID 6890N de marque Agilent technologies (Santa Clara, Etats-Unis) équipé d'une colonne apolaire et d'une colonne polaire. Pour l'analyse de la dégra-dation des échantillons, le recours à la chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur de masse (GC-MS 5975, Agilent technologies (Santa Clara, Etats-Unis)) a été nécessaire. Les colonnes utilisées sont de phases identiques mais de dimensions diérentes. Les programmations ont alors dû être adaptées. Le gaz vecteur est l'hélium et la température d'injection est de 250 °C.

Sur colonne apolaire : HP1, 50m x 320mm x 0,25 mm (agilent technologies) la méthode chroma-tographique est la suivante (Norme AFNOR NF T75-400).

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 104

Méthode chromatographique :

Volume d'injection : 1 mL d'huile essentielle pure Injection split 120 :1

Pression constante : 13 psi

Programmation en température :

Echantillon : Huile essentielle pure

Sur colonne polaire : innowax 60m x 320mm x 0,25 mm (agilent technologies) la méthode chromatographique est la suivante (Norme AFNOR NF T75-400).

Méthode chromatographique : Volume d'injection : 1 mL Injection Split 100 :1

Débit constant : 1,3 mL/min

Programmation en température :

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 105

4.4 L'analyse chirale en GC-FID

Paramètres communs aux analyses chirales :

Appareillage :

GC-FID modèle 6890N (Agilent technologies (Santa Clara, United states))

Méthode chromatographique : T° injecteur : 250°C

Volume d'injection : 1 mL Gaz vecteur : H₂

4.4.1 Application à l'analyse chirale des terpènes a-pinène et

sabinène des citrus

4.4.1.1 Application à l'analyse de l' a-pinène

Colonne chirale : beta-Dex 325 (2,3-di-O-methyl-6-O-TBDMS-b-cyclodextrin) (25% dilué dans poly(20% phenyl/80% dimethylsiloxane)) 30m x 250mm x 0,25mm (Supelco, Sigma-aldrich, St-Louis, USA)

Méthode chromatographique : Injection split 80 :1

Débit constant : 1,2 mL/min

Programmation en température :

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 106

4.4.1.2 Application à l'analyse du sabinène

Colonne chirale : Cyclosil B (hepatkis (2,3-di-O-methyl-6-O-t-butyl dimethylsilyl)-ÿ-cyclodextrin) 30m x250mm x0,25mm (agilent technologies)

Méthode chromatographique : Injection split 100 :1

Débit constant : 1,2 mL/min

Programmation en température :

Echantillon : purication préalable (cf. section 4.2)

4.4.2 Application à l'analyse chirale du citronnellal dans les citrus

Colonne chirale : HYDRODEX b-6TBDM ( heptakis-(2,3-di-O-methyl-6-O-t-butyldimethyl-silyl)-b-cyclodextrin) (dilué dans du polysiloxane), 50m x 250mm x0,25 mm (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne)

Méthode chromatographique : Injection split 50 :1  20 :1 Débit constant : 1,3 mL/min

Programmation en température :

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 107

4.4.3 Application à l'analyse chirale du linalol dans les citrus

Colonne chirale : Cyclosil B (hepatkis (2,3-di-O-methyl-6-O-t-butyl dimethylsilyl)-ÿ-cyclodextrin)(30% dilué dans DB-1701) 30m x 250mm x 0,25mm (agilent technologie)

Méthode chromatographique : Injection split 60 :1

Débit constant : 1,2 mL/min

Programmation en température :

Echantillon : purication préalable (cf. section 4.2)

4.4.4 Application à l'analyse chirale de l'a-terpinéol dans les citrus

Colonne chirale : Cyclosil B (hepatkis (2,3-di-O-methyl-6-O-t-butyl dimethylsilyl)-ÿ-cyclodextrin)(30% dilué DB-1701) 30m x 250mm x 0,25mm (agilent technologie)

Méthode chromatographique : Injection split 60 :1

Débit constant : 1,2 mL/min

Programmation en température :

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 108

4.4.5 Application à l'analyse chirale du linalol, acétates de linalyle

et lavandulyle dans la bergamote et les lamiacées

Colonne chirale : Sur colonne 6-tertiobutyl dimethylsilyl, 2x3 diethyl-b-cyclodextrine (50% di-lué PS086) 25m x 250mm x 0,25mm (Méga, Legano, Italie)

Méthode chromatographique : Injection split 100 : 1

Débit constant : 1,3 mL/min (programme à débit constant)

Programmation en température :

Echantillon : 0,5 mL d'échantillon est dilué dans 1,5 mL d'éthanol pour l'analyse du linalol et de l'acétate de linalyle. Par contre l'analyse de l'acétate de lavandulyle nécessite une puri-cation préalable (cf. section 4.2)

4.5 L'analyse en GC-MS

L'analyse GC-MS des huiles essentielles a été dans un premier temps utile à l'identication des composés de dégradation. Ensuite les limites de l'analyse chirale unidimensionnelle ont été partiellement palliées par l'utilisation de la GC-MS équipée d'une colonne chirale. L'analyse des PMF a aussi été eectuée en GC-MS.

Paramètres communs aux analyses :

Appareillage : GC 6890N et 7890N couplé à un spectromètre masse 5975 quadripolaire en mode d'ionisation par impact électronique 70eV (Agilent technologies)

Réglage de la source : Les températures de la source et du quadripôle sont respectivement de 150°C et 230°C. Le gaz vecteur est à une pression de 36 psi. L'ionisation par impact électro-nique 70eV. Deux modes sont utilisés au cours de l'étude : Total Ion Current (TIC) qui réalise un scan de chaque molécule et Selected Ion Monitoring (SIM) focalisant les ions sélectionnés sur une fenêtre de temps donnée. Le mode scan est réglé tel que les masses de 35 à 500 uma soient

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 109

balayées à une vitesse de 7,76 scan/s. Les banques de données utilisées pour l'identication de molécules à partir de spectres de masses sont les bases NIST, WILEY et celle interne au laboratoire.

Méthode chromatographique : T° injecteur : 250°C

Ligne de transfert : 300°C Gaz vecteur : He

4.5.1 Méthode chromatographique GC-MS appliquée à l'analyse de

la fraction volatile des huiles essentielles sur colonne HP1

(apolaire)

Méthode chromatographique : Volume d'injection : 0,2 mL Injection split 100 :1

Débit constant : 1,3 mL/min

Programmation en température :

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 110

4.5.2 Méthode chromatographique GC-MS appliquée à l'analyse de

la fraction volatile des huiles essentielles sur colonne Innowax

(polaire)

Méthode chromatographique : Volume d'injection : 0,2 mL Injection Split 100 :1

Débit constant : 1,3 mL/min

Programmation en température :

Echantillon : Huile essentielle sans prétraitement

4.5.3 Méthode chromatographique GC-MS appliquée à l'analyse des

PMF

Colonne moyennement polaire : DBXLB, 30m x 250mm x 0,25mm Agilent Technologies

Méthode chromatographique : T° injecteur : 320°C

Volume d'injection : 0,2 mL Injection splitless pulsée Débit constant : 1 mL/min

Programmation en température :

a a a

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 111

Méthode SIM appliquée à l'analyse des PMF d'huiles essentielles de bergamote, mandarine, pamplemousse et orange :

Voici les ions sélectionnés pour mettre la méthode SIM en place. Chaque groupe correspond à une fenêtre de temps disctinctes, an de cibler chacunes des PMF et d'abaisser le bruit de fond.

Groupes Masses ions (uma) 1 Masses ions (uma) 2 Masses ions (uma) 3

Groupe 1 371 387 402 Groupe 2 314 357 372 Groupe 3 284 327 342 Groupe 4 401 417 432 Groupe 5 371 387 402 Groupe 6 371 387 402 Groupe 7 313 357 372

Table 4.2: Ions sélectionnés pour la méthode SIM

Chaque groupe d'ions est analysé sur une fenêtre de temps réduite car ces ions ne sont pas parfaitement spéciques des PMF. Les fenêtres de temps doivent être établies selon l'état de la colonne.

Echantillon : huiles essentielles puriées (cf section 4.2) pour les huiles essentielles de manda-rine, pamplemousse et orange. Huiles essentielles sans prétraitement pour celles de bergamote et citron.

Methode par extraction d'ion appliquée à l'huile essentielle de citron :

Une extraction des ions 327, 357, 387 et 417 est eectuée. Cette méthode d'exploitation a permis d'abaisser la limite de détection et d'éliminer les coélutions présentes lors de la méthode SCAN. Pour cet agrume, le mode SIM n'a pas été utilisés. En eet les teneurs variables en PMF n'ont pas permis de sélectionner une fenêtre de temps pour chaque molécule, adaptée à tous les échantillons.

4.5.4 Méthode chromatographique GC-MS appliquée à l'analyse

chirale

Les méthodes chromatographiques sur colonnes chirales sont identiques à celles employées en GC-FID. Seul le gaz vecteur est diérent car le dihydrogène, utilisé en GC-FID réagirait

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 112

avec les ions issus de la fragmentation.

4.6 L'analyse isotopique

Appareillage : C/py-IRMS modèle isoprime de la société GV instrument (Manchester, United Kingdom).

La source est réglée an d'obtenir un compromis entre répétabilité et intensité du signal. Pour l'analyse du carbone la stabilité du signal est privilégiée au dépend de l'intensité, pour l'hydrogène la source est paramétrée pour un maximum d'intensité avec une stabilité acceptable. Toutes les dix analyses des  pics center  automatiques sont réalisés an de refocaliser le faisceau d'ions en adaptant le voltage (accelerating voltage) de la source (cf. gure 4.3). Ceci permet de conserver une bonne répétabilité de mesure au cours d'une longue série d'analyse.

L'analyse isotopique n'est pas aussi robuste que peuvent être celles en FID ou en GC-MS. An de vérier le bon fonctionnement, avant chaque série d'analyse, la stabilité et la linéarité de l'IRMS sont vériées. Il s'agit d'injecter consécutivement 10 fois la même concen-tration (stabilité) ou des concenconcen-trations diérentes (linéarité) d'un gaz référence dont les valeurs isotopiques sont connues. L'appareil est prêt à l'emploi, s'il remplit les conditions données par le constructeur, c'est-à-dire si la stabilité et la linéarité donne un écart type inférieur à 0,3 ‡ pour les rapports isotopiques du carbone et inférieur à 4‡ pour les rapports isotopiques de l'hydro-gène. En eet l'analyse du deutérium est moins répétable car il est 100 fois moins abondant que le carbone 13. L'appareil est certié linéaire entre 1 nA et 10 nA (données constructeur). En pratique, pour la plupart des molécules les résultats sont linéaires jusqu'à 15 nA, tandis que pour des intensités inférieures à 1nA, la linéarité de la mesure devra être démontrée au cas par cas. Ensuite un mélange de 4 ou 5 paranes avec une méthode adaptée à la colonne utilisée, est analysé an de vérier l'injection, la colonne et, la combustion ou la pyrolyse. Chaque appareil de mesure isotopique que ce soit en AE-IRMS ou GC-C/py-IRMS possède un biais qui lui est propre suivant la molécule analysée. L'utilisation de standards certiés par l'IAEA permet de mesurer le biais de l'appareil an de s'en aranchir, les valeurs obtenues sont ensuite corrigées. N'ayant pas de molécule standard validée par l'IAEA, nous devons donc analyser les molé-cules d'intérêt sur l'AE-IRMS pour obtenir des valeurs dans le référentiel international que l'on utilisera en mélange comme standard en GC-C/Py-IRMS et qui permettront la correction. Au début de chaque série d'analyse ces mélanges de standards sont injectés deux fois, puis injectés une fois toutes les dix analyses.

Aussi les tubes à combustion et pyrolyse ont une durée de vie limitée. Dans le cas du carbone, le tube doit être ré-oxydé régulièrement par passage d'oxygène gazeux. En ce qui concerne le tube à pyrolyse, celui-ci ne pouvant être régénéré (pas de montage sur ISOPRIME pour la

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 113

régénération et hydrogène dangereux à haute température), sa durée de vie sera plus courte. Travailler avec un tube dégradé, entraine une combustion ou pyrolyse incomplète des molécules d'où des valeurs isotopiques erronées.

4.6.1 Conditions expérimentales en GC- C-IRMS

13

C

La vérication de facteur 18O permet d'évaluer la nécessité de régénérer le tube à combus-tion. Ce facteur est utilisé comme correction pour obtenir la valeur nale. Cette valeur doit donc être rigoureusement contrôlée. En eet lorsque le tube manque de CuO réducteur, la valeur de l'18O sature autour de -50 d18O. Pour travailler dans de bonnes conditions l'expérience montre qu'il faut travailler entre -5 et -40 d 18O. Un ux d'oxygène balaye le tube pendant toute une nuit an de le régénérer. Après ré-oxydation du tube à combustion, il est nécessaire de laisser un ux d'hélium pendant quelques minutes avant analyse an d'éliminer l'oxygène restant dans le tube. Les mesures sont corrigées uniquement si l'écart est supérieur à 0,6 % entre la valeur en AE-IRMS et celle en GC-C-IRMS.

Les paramètres de la source utilisés sont les suivants :

Figure 4.3: Paramètres de la source établie avec le logiciel d'exploitation Isoprime, pour l'analyse isotopique du 13C

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 114

Paramètres communs aux analyses isotopiques du carbone 13 :

Séparation GC :

GC-FID: Agilent 6890N Technologies (Santa Clara, United States)

Méthode isotopique :

Standard externe en bouteille de gaz CO2 de valeur isotopique connue, mesurée sur autre ap-pareil IRMS.

Méthode chromatographique : T° injecteur : 260° C

Volume d'injection : 1 mL

4.6.1.1 Application à l'analyse de terpènes des citrus Méthode isotopique :

Analyse FIDjusqu'à 5 minutes pour éliminer le solvant Ensuite analyse IRMS de l'a-pinène, sabinène et myrcène Analyse FIDà partir de 16 minutes

Méthode chromatographique :

Colonne polaire : Innowax, 60m x 250mm x 0,25mm Agilent Technologies (Santa Clara, United States)

Split 100 :1-120 :1

Débit constant : 1,5 mL/min

Programmation en température : isotherme à 90°C pendant 16 min

Echantillon : Huile essentielle sans prétraitement.

Méthode chromatographique appliquée à l'analyse isotopique de l'a-pinène, le sabinène et le myrcène de la bergamote, citron et mandarine :

L'analyse est un peu diérente car ces huiles contiennent plus de b-pinène et cela aecte la résolution de ce composé avec le sabinène.

Injection split 120 :1

Débit constant : 1,5 mL/min

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 115

Echantillon : Huile essentielle sans prétraitement.

a a a a

Méthode chromatographique :

Colonne polaire : Innowax, 60m x 250mm x 0,25mm Agilent Technologies (Santa Clara, United States)

Split 100 :1

Débit constant : 1,5 mL/min

Programmation en température : isotherme à 90°C pendant 20 min

Echantillon : Huile essentielle à une dilution de 100 :1

4.6.1.2 Application à l'analyse du linalol et acétate de linalyle de la bergamote et des lamiacées

Méthode isotopique :

Analyse FID jusqu'à 15 minutes

Ensuite analyse IRMS du linalol et acétate de linalyle Analyse FID à partir de 42minutes

Méthode chromatographique :

Colonne polaire : Innowax, 60m x 250mm x 0,25mm Agilent Technologies (Santa Clara, United States)

Split 80 :1

Débit constant : 1,5 mL/min

Programmation en température :

CHAPITRE 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES 116

4.6.1.3 Application à l'analyse du citral Méthode isotopique :

Analyse FID jusqu'à 4 minutes

Ensuite analyse IRMS du linalol et acétate de linalyle Analyse FID à partir de 12 minutes

Méthode chromatographique :

Colonne DBXLB 30m x 250mm x 0,25mm Agilent Technologies (Santa Clara, United States) Injection split 30 :1

Débit constant : 1,2 mL/min

Programmation en température :

La méthodologie a été adaptée aux échantillons dégradés.

Echantillon : Huile essentielle sans prétraitement.

4.6.2 Conditions expérimentales en GC-py-IRMS

2

H

Le suivi de l'évolution du tube à pyrolyse est moins aisé en analyse du deutérium. L'injection régulière de paranes permet de vérier que l'écart ne varie pas de manière signicative entre les valeurs obtenues au cours de la série d'analyse. Le procédé de correction est diérent de celui appliqué pour l'analyse du carbone. En eet l'incertitude de l'AE-IRMS est trop importante

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