Matériels et méthodes

2.2.3.1. Produits chimiques et réactifs

Les protéines recombinantes, les microsomes de foies humains (HLM) et les microsomes intestinaux humains (HIM) ont été achetés chez BD Biosciences (Woburn, MA, USA). L’eau de grade LC-MS a été achetée chez EMD Milipore (Billerica, MA, USA). L’acétonitrile de grade LC-MS, la trypsine, le dithiothréitol (DTT), le potassium phosphate, le Tris et l’ammonium bicarbonate (ABC) ont été achetés chez Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA). L’acide formique, l’albumine sérique humaine (HSA), l’iodoacétamide (IAA) et l’acide trifluoacétique (TFA) ont été achetés chez Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA). Les peptides

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protéotypiques et les standards internes stables marqués isotopiquement ont été synthétisés par New England Peptide (Boston, MA, USA).

2.2.3.2. Identification des peptides protéotypiques

La quantification absolue (AQUA) de protéines par LC-HRMS ne s’effectue pas sur la protéine entière et requiert la sélection de peptides protéotypiques spécifiques à la protéine d’intérêt. Les peptides protéotypiques sont obtenus suivant l’action d’une enzyme de digestion, la trypsine. Une première digestion trypsique in silico va permettre de sélectionner plusieurs peptides protéotypique théoriques pour chaque isoenzyme. Ensuite, chacune des étapes de la digestion trypsique doit être optimisée afin de sélectionner, par digestions in vitro, le peptide ayant le meilleur profil afin de permettre une quantification spécifique et sensible de la protéine d’intérêt. La digestion in silico permet de déterminer tous les peptides pouvant être théoriquement obtenus par digestion trypsique pour une protéine d’intérêt. La base de données UniProtKB/Swiss-Prot a été utilisée pour déterminer les séquences d’acides aminés de chaque CYP450 d’intérêt. Tous les peptides pouvant être observés par digestion trypsique ont été générés à l’aide du logiciel mMass en rentrant la séquence d’acides aminés de chaque protéine. Puis, les peptides protéotypiques in silico sont sélectionnés en fonction de critères spécifiques comme la taille de leurs séquences, les polymorphismes, les acides aminés instables, les clivages manqués par la trypsine et la spécificité du peptide.

Les peptides sélectionnés théoriquement sont ensuite analysés par digestions in vitro en utilisant des cytochromes recombinants purifiés. Succinctement, les étapes de digestion trypsique sont les suivantes : 25 µg de protéines recombinantes totales sont diluées en duplicata dans un tampon, puis les protéines sont réduites et alkylées par le DTT et le IAA, respectivement. Les protéines sont ensuite digérées par la trypsine à 37 °C et à un pH se situant entre 7,5 et 8,5. Les standards internes stables isotopiquement marqués n’étant pas synthétisés avant l’optimisation de la méthode de digestion, un peptide non humain dilué dans du 0,1% TFA dans l’eau est rajouté après la digestion pour éliminer toutes sources de variabilité qui seraient dues à l’injection par l’appareil.

Après avoir optimisé la méthode de digestion, chaque isoenzyme recombinante est digérée afin de sélectionner les peptides ayant une saturation de la réponse enzymatique. Ensuite, les peptides protéotypiques sont départagés selon trois critères qui sont les suivants : les peptides

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ayant des acides aminés avec modifications post-traductionnelles (MPT), les peptides ayant une succession d’acides aminés arginine et lysine en C-terminal et finalement, les peptides ayant une proportion de clivage manqué trop importante. Ce dernier paramètre a été déterminé à l’aide du logiciel informatique Proteome Discoverer™.

Les critères de sélection détaillés ci-dessus permettent ainsi de sélectionner un peptide protéotypique et spécifique à chaque isoenzyme des CYP450s.

2.2.3.3. Solution stock et courbe de calibration

Les solutions stock de tous les peptides protéotypiques et de leurs standards internes synthétisés sont préparées dans du 0,1% TFA dans l’eau à 1 mg/mL et 0,2 mg/mL, respectivement. Étant donné qu’il n’existe pas de blanc de microsomes à utiliser comme matrice, une solution de 1 mg/mL de HSA digérée est utilisée afin de représenter au mieux la complexité des échantillons biologiques et les quantités de protéines qui pourraient être retrouvées dans les microsomes humains et qui pourraient interférer avec les analyses. Une solution stock contenant tous les peptides est préparée à 25 µM puis diluée dans du 0,1% TFA dans l’eau pour obtenir une série de 5 solutions à différentes concentrations. Pour les standards de calibration et les contrôles qualités, 1 mg/mL de HSA digérée est fortifiée avec les solutions contenant tous les peptides, pour obtenir la gamme de concentrations suivante : 0,25; 0,5; 1; 2,5; 100; 200 nM. Une solution stock contenant tous les standards internes stables marqués isotopiquement est préparée dans du 0.1%TFA dans l’eau à 100 nM et est ajoutée aux échantillons.

2.2.3.4. Conditions chromatographiques et spectromètre de

masse

Les analyses LC-HRMS sont réalisées avec un système UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) Ultimate 3000 XRS couplé à un spectromètre de masse hybride quadripôle-orbitrap Q exactive de chez Thermo Scientific (San José, CA, USA). Les deux propriétés « quadripôle » et « orbitrap » du spectromètre de masse permettent de quantifier les peptides par MS1 (MS simple) selon leur masse à ± 5 ppm mais également par MS2 (MS en tandem) pour confirmer l’analyse du peptide d’intérêt grâce à son profil de fragmentation. La séparation chromatographique est réalisée avec une colonne Biobasic-8 (5 µ, 100 x 2.1 mm) de Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) chauffée à 40 °C et un gradient de phase

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mobile composé de 0.1% acide formique dans l’acétonitrile (solvant A) et 0.1% acide formique dans l’eau (solvant B). Le gradient est comme suit : 5% de solvant A pendant 1 min, gradient linéaire de 5-40% de solvant A pendant 19 min, 40% de solvant A pendant 1 min puis 5% de solvant A pendant 9 min.

Le spectromètre de masse est constitué d’une source d’ionisation par électro nébulisation (HESI) qui opère en mode positif avec les paramètres de source suivants : voltage de l’électrode à 3500 V, température de vaporisation à 400 °C et température du capillaire à 350 °C. Le nitrogène est utilisé pour les gaz « sheath », « auxiliary » et « sweep » et sont fixés à 35, 30 et 2 en unités arbitraires. Les masses M, les états de charges z et les masses exactes de l’ion précurseur [M+zH]z+ _{pour chaque peptide protéotypique et son standard interne sont déterminés} avec le spectromètre de masse.