Matériels et méthodes

II.3.1 Milieux tests

L’eau ultrapure à 18,2 MΩ-cm de résistivité est obtenue par un appareil Purelab (Elga). L’eau synthétique modérément dure a été préparée à partir d’eau ultrapure selon les recommandations de l’EPA. Elle a la composition suivante : NaHCO₃ 96 mg/L; CaSO₄, 2H₂O 60 mg/L; MgSO₄ 60 mg/L et KCl 4 mg/L. Le milieu MM, utilisé pour Synechocystis, est un milieu minéral BG11 (Rippka et al., 1979) supplémenté avec 0,2 g·L^-1 de Na2CO3 (Labarre et

al., 1989) et tamponné à pH=7 avec 6 mM d’HEPES (acide N-2

hydroxyéthylepipérazine-N-éthane-sulfonique) (Figure 10). Le milieu LB utilisé pour Escherichia coli est le milieu classique Luria-Bertani (Sambrook et al., 1989).

Tous les milieux sont stérilisés par autoclavage avant utilisation.

II.3.2 Cultures cellulaires

• Synechocystis PCC 6803

La souche sauvage de Synechocystis PCC6803 provient de la collection de l’institut Pasteur (Paris). En conditions standards, elle est cultivée à 30°C dans le milieu minéral MM. Les cultures sont effectuées en milieu liquide, dans un agitateur orbital (180 rpm) à rampes lumineuses (Infors Multitron II) ou sur milieu solide, obtenu par ajout de 10 g·L^-1 de Bacto Agar (Difco). La lumière blanche est obtenue par des tubes néons (Mazda TF 16 W) et l’intensité lumineuse standard de culture est fixée à 2500 lux (≈31,25 µE/m²/s). La concentration cellulaire est déterminée par turbidité à 580 nm (une unité de Densité Optique (DO) correspondant à 5·10⁷ cellules/mL). La vitesse de croissance de la souche de type sauvage (temps de doublement du nombre de cellule) est d’environ 10h à 2500 lux. Les cultures sont maintenues en phase exponentielle (3 repiquages minimum) et utilisées à DO ≈ 0,5 lors des tests en présence de nanoparticules. L’antibiotique utilisé pour sélectionner la présence de plasmides d’expression ou de cassettes de délétion est la Kanamycine (Km) à une concentration de 50 à 300 µg/mL.

• Escherichia coli RR1

La souche d’Escherichia coli (E. coli) RR1 recA⁺ [F^-, hsdS20 (rB^-, mB^-), leuB6, ara-14,

Chapitre II : Présentation des modèles

comme souche sauvage d’E.coli. Les cultures sont effectuées en milieu LB liquide, dans un agitateur (200 rpm) maintenu à l’obscurité, dans le milieu de culture LB à 37°C. Les cellules sont remises en culture dans du milieu LB propre, la veille des expériences, à partir de cultures conservées au congélateur à -80 °C. Lors des tests en présence de nanoparticules, elles sont utilisées en phase de ralentissement (DO600nm ≈ 2).

La souche d’E. coli TOP10 [F^-, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ ∆lacX74 nupG

recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(Str^R) endA1 λ-] (Invitrogen) a été utilisée pour l’amplification de plasmides lors des constructions génétiques et clonages. L’antibiotique utilisé pour sélectionner la présence des plasmides est l’Ampicilline (Amp :100 µg/mL ).

II.3.3 Préparation des cultures pour les tests avec NPs

Les cultures cellulaires ont été systématiquement lavées trois fois dans le milieu de contact de l’expérience (eau ultrapure ou eau synthétique modérément dure ou milieu de culture) avant ajout des nanoparticules ou des toxiques, de la façon suivante :

• une fraction de culture de Synechocystis en phase exponentielle (entre 10 et 40 mL suivant les tests) est prélevée, lavée 3 fois (par centrifugation de 10 min à 4500 g, 20°C, puis le culot est resuspendu dans le milieu du test) et la concentration cellulaire ajustée à 2,7 ⋅ 10⁷ cellules/mL (DO580nm ≈ 0,5).

• Une fraction de culture de E. coli (entre 10 et 40 mL suivant les tests) en phase stationnaire (mise en culture la veille du test) est prélevée, lavée 3 fois (par centrifugation de 3 min à 4500 g, 20°C, puis resuspension du culot dans le milieu du test) est ajustée à 5 ⋅ 10⁸ cellules/mL (DO600nm ≈ 2).

II.3.4 Préparation des nanoparticules et ions

• Nanoparticules de CeO2

Les nanoparticules de CeO2 ont été synthétisées par Rhodia. Elles se présentent sous forme d’une poudre jaune, référence : OPAL 18 bis, lot : 90192/99, de composition suivante : CeO2(HNO3)1/2, 4H2O. Les suspensions ont été préparées par ajout de 20 g d’eau ultrapure à 0,32 g de la poudre de nanoparticules afin de former une suspension mère à 10 g/L de CeO2 (soit 58 mM). La suspension est agitée manuellement quelques minutes ; elle forme naturellement une suspension stable (nanoparticules chargées positivement). La suspension est ensuite laissée à reposer pendant 24h puis filtrée sur filtre stérile 0,22 µm. Les dilutions

Chapitre II : Présentation des modèles

de la suspension mère sont préparées juste avant les tests par dilutions successives (en général de 2 en 2) dans de l’eau ultrapure stérile.

• Nanoparticules de CeO2-PAA

Les nanoparticules de CeO₂ fonctionnalisées (par physisorption) par de l’acide polyacrylique (PAA) ont été obtenues par la méthode de Sehgal et al., 2005. La suspension mère est stable et contient 3,5 g/L de CeO₂. Les nanoparticules sont chargées négativement. Les dilutions de la suspension mère sont préparées juste avant les tests par dilutions successives (en général de 2 en 2) dans de l’eau ultrapure stérile.

• Solution de Ce³⁺

Les solutions de Ce³⁺ sont préparées à partir de 0,5 g de Ce(NO3)3, 6H2O (97%, Rectapur) dans 20 g d’eau ultrapure. La solution obtenue à 58 mM de cérium est filtrée sur filtre stérile 0,22 µm puis diluée juste avant les tests par dilutions successives (en général de 2 en 2) dans de l’eau ultrapure stérile.

Chapitre II : Présentation des modèles

II.4 Références bibliographiques

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