Bactéries + milieuxMilieux et eau

Bactéries + H

O

Tableau 7 - Résumé des quantifications Ce^III/Ce obtenues en XANES pour différentes conditions de contact. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 5,7 5,71 5,72 5,73 5,74 5,75 5,76 Energie (keV) A b s o rb a n c e n o rm é e CeIV 4 ppm 8 ppm 10 ppm 16 ppm

Figure 32 Spectres XANES de pastilles des échantillons « LB + E. coli -3h » à différentes concentrations en nanoparticules de CeO₂.

Les concentrations correspondent aux concentrations en CeO₂ dans les échantillons liquides avant lyophilisation.

En revanche, les nanoparticules présentent une réduction beaucoup plus importante dans le milieu LB en présence d’E. coli. Plus la concentration en nanoparticules y est faible et plus la réduction est proportionnellement importante. Ceci est illustré sur le graphique Figure 32. Ces résultats confirment des observations antérieures réalisées sur la ligne LUCIA (Thill et

al., 2006). On notera cependant que des échantillons préalablement analysés sur LUCIA ont

été réanalysés sur BM30b (sur des zones différentes des échantillons) et ont montré des réductions nettement inférieures (diminution de 80% de réduction à 50%) ; peut-être la conséquence d’une réduction sous faisceau sur LUCIA. En effet, cette ligne possède un microfaisceau de densité de photons 10⁶ fois plus grande que sur la ligne BM30b de l’ESRF, ce qui a pu forcer la réduction des échantillons. Nous avons confirmé que ce phénomène de réduction sous faisceau était absent à BM30b en comparant les échantillons soumis à des temps plus ou moins longs d’analyse.

Une deuxième série d’expériences a été également tentée sur des échantillons liquides afin de suivre la cinétique de réduction du cérium en présence de cellules (protocole décrit dans la partie matériels et méthodes). Cependant, les concentrations de cérium dans les suspensions cellulaires étaient en limite de détection de la ligne, les échantillons ont donc été préalablement concentrés (5 fois) par centrifugation. Malgré cela, les temps d’acquisition (15 min) imposés par la résolution cinétique recherchée étaient trop courts pour permettre une modélisation correcte des spectres. De ce fait, l’extraction objective des taux de Ce^III s’est avérée impossible.

Les résultats communs aux deux techniques d’analyse (XPS et XANES) sont les suivants : • une absence de réduction dans l’eau ultrapure en présence des deux types de cellules

(quantité de Ce^IV identique à celle trouvée dans l’eau seule) et

• une réduction du Ce^IV en Ce^III (visible par la diminution de la quantité de Ce^IV) dans le milieu LB en présence de cellules d’E. coli.

Les analyses XPS montrent également un phénomène de réduction en présence de cellules de

Synechocystis dans le MM, mais ceci n’a pas été confirmé par les analyses XANES,

probablement à cause d’une différence dans la géométrie de l’expérience. En effet, dans le cas de l’XPS, les cellules sont majoritaires par rapport aux nanoparticules seulement présentes sur la surface du mica. De plus dans le cas du XANES, le contact a lieu, non pas avec une surface

Chapitre IV : Physicochimie des interactions

macroscopique de nanoparticules, mais avec des nanoparticules individualisées. Il faut également noter que l’analyse XANES permet la spéciation de l’ensemble des atomes de cérium présents en solution tandis que l’XPS analyse uniquement les nanoparticules encore restantes sur le mica. Pour toutes ces raisons, il est délicat d’extrapoler les résultats obtenus en XPS à ceux obtenus en XANES.

IV.3.3Conclusions sur les mécanismes d’oxydoréduction

Ces expériences ont mis en évidence une absence de réduction des nanoparticules lorsqu’elles sont en contact de cellules dans l’eau. En revanche, dans les milieux de culture, la réduction semble dépendre du modèle biologique et du type de contact entre nanoparticules et cellules. En effet, il y a :

• réduction dans le cas d’E. coli,

• réduction absente ou limitée dans le cas d’un contact avec Synechocystis. Le fait qu’aucune réduction ne soit observée dans l’eau en présence d’E. coli laisse supposer, dans le LB, un mécanisme de réduction du cérium induit par E. coli. En effet, si la réduction observée était simplement la résultante d’une oxydation des bactéries par les nanoparticules (hypothèse concevable vue le contact intime entre nanoparticules et bactéries), cette réduction serait également observée dans l’eau. La réduction est donc bien induite par les bactéries dans leur milieu culture, probablement par la production de radicaux libres, et non par les nanoparticules.

Les radicaux libres sont naturellement produits par les cellules et sont nécessaires à leur bon fonctionnement. Ils sont notamment impliqués dans des mécanismes de régulation destinés à répondre au stress oxydant et à rétablir l’homéostasie de la cellule (Droge, 2002). Cependant, de trop fortes concentrations en radicaux libres peuvent conduire à des modifications irréversibles des protéines et acides aminés cellulaires (espèces les plus sensibles aux phénomènes redox). Ils peuvent même à terme entrainer la mort cellulaire (Droge, 2002). De plus, de récentes études ont montré une augmentation de la durée de vie de cellules exposées à des nanoparticules d’oxyde de cérium (Karakoti et al., 2008). Selon ces auteurs, les défauts électroniques présents dans les nanoparticules permettent à ces dernières de jouer le rôle « d’éponges » à radicaux libres en passant de l’état d’oxydation 4 à l’état d’oxydoréduction 3 du cérium. La concentration en radicaux libres dans le milieu de culture serait ainsi diminuée, ce qui favoriserait le prolongement de la vie cellulaire.

Chapitre IV : Physicochimie des interactions

Le fait qu’aucune réduction ne soit observée dans l’eau ultrapure réside sans doute dans le ralentissement du métabolisme des cellules. En effet, l’eau ultrapure est dépourvue des nutriments indispensables aux réactions métaboliques d’oxydoréduction. Ceci limite donc la production des radicaux libres. De plus, la différence de pression osmotique provoquée par l’absence de sels conduit probablement à une limitation des échanges entre l’intérieur de la cellule et l’extérieur. Les radicaux libres sont, de ce fait, moins libérés dans le milieu de culture.

Concernant Synechocystis, la réduction très limitée est probablement due à la présence d’exopolysaccharides. En effet, d’après Liu et al., 2007, les EPS protègent les cellules qui les possèdent des effets des irradiations en piégeant les radicaux libres . De plus, la réduction observée chez E .coli dépend de la quantité de bactéries en contact direct avec les nanoparticules. Le contact direct étant évité par la présence d’EPS dans le cas des expériences réalisées en milieu dispersé liquide (cas XANES), ceci explique l’absence de phénomènes de réduction. On aurait toute fois pu s’attendre à des phénomènes de réduction entre EPS et NPs car le Ce^IV est utilisé comme catalyseur dans les réactions de polymérisation vinylique du glucose et de la cellulose (Pottenger and Johnson, 1970) et également de polymérisation par émulsion des alkylcyanoacrylates (Chauvierre et al., 2003). En effet, il a été démontré qu’il produit des radicaux libres sur la cellulose (Pottenger and Johnson, 1970) et sur le dextran (Chauvierre et al., 2003) par formation d’un complexe de coordination. Ce n’est cependant pas ce qui a été observé dans cette étude probablement à cause du pH du milieu de contact qui est nettement supérieur au pH utilisé dans ce type de réaction de polymérisation où pH ≈1.

Il reste à présent à vérifier l’impact d’une incubation en présence de nanoparticules sur les réponses cellulaires (croissance, mortalité, intégrité membranaire) et à les confronter aux mécanismes d’oxydoréduction observés. Ceci sera l’objet du chapitre suivant.

Chapitre IV : Physicochimie des interactions

IV.4 Matériels et méthodes

IV.4.1Electrophorèse capillaire

Les cultures de bactéries (Synechocystis et E. coli) ont été cultivées dans leur milieu respectif puis lavées dans l’eau ultrapure de la façon décrite dans la partie matériels et méthodes II.3.3. Puis les cultures ont été aliquotées en fractions de 2 mL. L’ajout de 100 µ L de dilutions de suspensions de NPs de CeO₂ initialement à 10 g⋅L^-1 (préalablement stérilisée par filtration sur filtre 0,22 µm) aux fractions de suspensions cellulaires est effectué sous agitation (vortex). Les cultures contenant les nanoparticules ont ensuite été placées dans leurs incubateurs respectifs pendant 30 min. A l’issue de cette période d’incubation, les cultures ont été centrifugées (10 min à 4 500 g) et 1mL de chaque surnageant a été prélevé puis analysé en électrophorèse capillaire.

Chacune des séries d’échantillons a été doublée pour s’assurer de leur reproductibilité.

La méthode d’analyse par électrophorèse capillaire a préalablement été validée par construction d’une isotherme d’adsorption de nanoparticules d’oxyde de cérium sur un modèle connu : des billes de latex (voir annexe p.313).

• Dissolution des NPs pour l’analyse en électrophorèse capillaire

Les nanoparticules de CeO2 ayant une grande affinité pour le verre, leur adsorption sur le capillaire en silice fondu de l’électrophorèse capillaire risquait de fausser les analyses. Les analyses par électrophorèse capillaire ont donc nécessité une étape préliminaire de réduction-dissolution des nanoparticules d’oxyde de cérium afin de les transformer en cations Ce³⁺ analysables en électrophorèse. Cette étape a été réalisée par l’ajout d’acide sulfurique concentré (dissolution des nanoparticules) et de sel de Mohr (réduction des nanoparticules). Le sel de Mohr (NH₄)₂ Fe(SO₄)₂, 6H₂O a été préparé par dissolution de 38 g du solide dans 20 mL d’acide sulfurique concentré. La solution à 0,5 M ainsi obtenue a ensuite été diluée 50 fois afin de travailler avec une solution à 10 mM.

La quantité de sel de Mohr à ajouter a été calculée afin d’obtenir une réduction totale du cérium, tout en limitant l’ajout d’acide sulfurique. Celui-ci est en effet responsable de phénomènes de saturation de l’électrophorèse capillaire lorsque qu’il est présent en trop grande quantité dans les échantillons.

Chapitre IV : Physicochimie des interactions

Afin d’établir le bilan de matière, la quantité maximale de nanoparticules potentiellement présentes en solution a été calculée à partir de l’échantillon contenant la concentration initiale maximale en nanoparticules.

Equation bilan : Ce⁴⁺(nanoparticules) + Fe²⁺ (sel de Mohr) →Ce³⁺ + Fe³⁺

Le ratio idéal (pour ne pas saturer l’électrophorèse mais réduire l’intégralité des atomes de cérium) a donc été établi pour : 150 µ L de sel de Mohr (10 mM) et 400 µ L d’échantillon.

• Préparation de l’électrolyte pour l’analyse en électrophorèse capillaire

L’électrolyte utilisé pour les analyses en électrophorèse capillaire a été préparé par ajout à 100 mg d’eau ultrapure de: 68 mg d’acide α-hydroxy-isobutyrique (HIBA, Aldrich) jouant le rôle d’agent complexant des cations et 64 µ L du chromophore UV-CAT1 (fournisseur : Waters). L’électrolyte a été homogénéisé pendant 24h par agitation magnétique avant utilisation. Le pH final de l’électrolyte était d’environ 4.

• Analyses en électrophorèse capillaire

Les analyses ont été réalisées sur une électrophorèse Beckman Coulter (P/ACE MDQ) avec un capillaire adapté à la détection des cations. Les mesures ont été réalisées à une tension de 25,2 kV.

IV.4.2Mobilité électrophorètique

Les échantillons qui ont servi à la mesure de la mobilité électrophorètique ont été préparés de la même manière que ceux mesurés pour l’isotherme d’adsorption. Les cultures ont été lavées dans l’eau puis mises en contact avec une solution de nanoparticules pendant 30 min - 1h (prise en compte du temps d’analyse). Les mesures de mobilité électrophorètique ont été effectuées à l’aide d’un zétasizer Nano ZS de marque Malvern. Les échantillons ont été placés dans des cellules en plastique jetables. Les mobilités ont été mesurées par un système de mesure de vélocité à l’aide d’un laser à effet Doppler. Ce type de mesure utilise la technique du retournement de champ électrique (inversion des bornes électriques aux électrodes). Le mode de mesure utilisé a été le mode General Purpose, combinaison du retournement de champ rapide (FFR : fast field reversal) afin d’éviter l’électroosmose et retournement de champ lent (SFR : slow field reversal) afin d’éviter l’électrodéposition.

Chapitre IV : Physicochimie des interactions

IV.4.3Microscopie électronique en transmission (MET)

Les cultures de Synechocystis et E. coli lavées dans les milieux étudiés ont été mises en contact pendant 3h en présence des nanoparticules de CeO₂ (conditions identiques à celles décrites dans le matériel et méthode II.3.3)

Les échantillons ont ensuite été fixés par du glutaraldéhyde 2,5 % pendant une heure (ajout de 0,2 mL de glutaraldéhyde 25% aux 2 mL d’échantillon). L’ajout du fixateur permet de conserver l’état morphologique des bactéries à un moment donné. Cette étape tue les cellules. Après une heure d’incubation, les échantillons ont été lavés plusieurs fois (par des cycles de centrifugation et remplacement du surnageant) avec de l’eau ultrapure. Puis une solution de métaperiodate à 1 % a été ajoutée aux échantillons et laissée incuber 15 min afin de rendre la paroi des bactéries perméable aux colorants. Cette étape a de nouveau été suivie de plusieurs lavages des échantillons à l’eau ultrapure. Puis les échantillons ont été mis à incuber dans 0,5 mL de milieu Karnovsky (fixateur et colorant membranaire) pendant 1h30. Ce milieu est composé de : 1% de tétraoxyde d’osmium, et 15 mg/mL de ferrocyanide de potassium. Après 1h30 d’incubation les échantillons ont été lavés 3 fois à l’eau ultrapure et centrifugés, puis les culots ont été enrobés dans 70 µ L d’une solution d’Agar 2 %. Après gélification, les inclusions ainsi obtenues ont subi des étapes de déshydrations successives dans des bains d’alcool de concentrations croissantes, puis ont été lentement infiltrées par la résine Epon pendant 18h. Les échantillons ont ensuite été coulés dans des moules, placés quelques minutes sous vide (pour retirer les bulles d’air de la résine) et laissés à polymériser pendant plusieurs jours (jusqu’à durcissement complet de la résine).

Les moulages obtenus ont ensuite été découpés à l’aide d’un couteau à diamant (Diatome AG) en sections ultrafines de 90 nm d’épaisseur dans un microtome (UCT-FCS ; Leica Microsystems). Ces coupes ultrafines ont été déposées sur des grilles de nickel recouvertes d’une pellicule carbonée (carbon-formvar nickel grid, Agar Scientific) et colorées avec du citrate de plomb (Reynold’s lead) ou de l’acétate d’uranyle. Les observations des coupes ont été réalisées avec un microscope Philips CM12 à 80 kV équipé d’une caméra US1000 Gatan.

IV.4.4Microscopie électronique à balayage (MEB)

Les échantillons observés ont été des cultures de Synechocystis repiquées plusieurs fois en phase exponentielle, puis lavées trois fois dans l’eau ultrapure et laissées à incuber pendant 3h